幽门螺杆菌18000u外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的:构建含幽门螺杆菌(Hp)18000u外膜蛋白编码基因的重组载体并在E.coli BL21中表达。为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础。 方法:用PCR从Hp染色体中,扩增18000u外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经Bam H I,Hind Ⅲ双酶切、纯化、连接,转化含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达。表达产物经纯化后,用ELISA法检测其抗原性。 结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp 18000 u的外膜蛋白编码基因,与Tomb等报道相比较,有2％编码基因发生变异,1.7％氨基酸残基改变。经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白为38000 u,其中pET32a(+)表达的蛋白约为20000 u,可溶性表达产物占全菌总蛋白的21.3％。重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95％以上。ELISA法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性。 结论:成功地克隆并表达Hp 18000 u的外膜蛋白编码基因,为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌外膜蛋白L和F基因单价、融合和联合DNA疫苗的免疫效果

铜绿假单胞菌是一种条件性人畜共患病原菌,不仅可引起人的烧伤感染、脓胸等疾病,还可引发禽类等动物的菌血症、败血症等。近年来,由于抗生素的大量应用,导致该菌的耐药性迅速上升,亟需一种更加有效的方式控制该病。本文以铜绿假单胞菌主要外膜蛋白编码基因oprL和oprF为基础构建了单价、二价融合和联合DNA疫苗,并对其免疫小鼠和鸡后诱导的体液、细胞免疫应答水平及攻毒保护效果进行了检测,旨在为研制新型高效的铜绿假单胞菌疫苗提供实验资料。

工程大肠杆菌高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的研究

细胞色素P450单加氧酶(P450BM3)能特异性催化脂肪酸ω碳位羟基化反应生成羟基脂肪酸,在前期构建携带单加氧酶基因P450BM3工程大肠杆菌(Escherichia coli)转化脂肪酸的基础上,为解决外源脂肪酸在羟基化过程中的消耗和转运问题,构建了脂酰基辅酶A合成酶基因(fadD)缺失和外膜蛋白编码基因(fadL)过表达的工程菌株。摇瓶条件下羟基十二酸产量达到748.8 mg/L,转化率为93.6%。

广东省历年流行性脑脊髓膜炎病原体分子特征分析

目的了解广东省历年流行性脑脊髓膜炎（流脑）病原体的外膜蛋白编码基因poM和porB基因特征，并确定病原体的优势克隆型。方法对1967-2007年从流脑患者分离的18株脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）进行复苏培养和生化鉴定；通过DNA序列测定分析外膜蛋白编码基因poM、porB特征；对菌株进行多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST），采用PHYLIP软件制作进化树，并与脑膜炎奈瑟球菌MLST全球数据库（PubMLST）中的菌株比较，确定优势克隆型菌株，探讨广东省历年流脑疫情分离株的看家基因序列多态性。结果porA可变区（VR）1的型别以20型为主，VR2的型别在2004年前主要为9型，以后呈现多态性；porB可变区Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ主要分别为4、7、11、10型，2004年后可变区Ⅴ、Ⅵ型别增多；除2007年分离的1株W135菌株外，其余菌株的porB基因均无Ⅶ、Ⅷ可变区。在7个看家基因中，abcZ等位基因多态性最低，pgm最高。广东省历年流行性脑脊髓膜炎分离株2004年前的优势克隆为ST-5克隆系，自2004年开始出现高致病性ST-4821克隆系，2007年首次出现高致病性ST-11克隆系。结论广东省历年脑膜炎奈瑟球菌分离株的外膜蛋白编码基因呈现多态性特征，分离株为多克隆系并存，近期以高致病性克隆系为主。