壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌外膜蛋白K微球疫苗的制备及其口服免疫效果

目的制备壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌外膜蛋白（outer membrane protein,omp）K微球疫苗,并检测其对大黄鱼的口服免疫效果。方法采用乳化-离子交联法制备副溶血弧菌ompK微球疫苗,筛选表面活性剂司盘-80添加量及壳聚糖包被浓度,经正交试验优化微球疫苗的制备工艺,筛选微球疫苗的冻干保护剂。检测采用优化条件制备的微球疫苗的理化特性及其在不同条件下的释放特性,并将微球添加到饵料中,连续5 d投喂大黄鱼,第28天以副溶血弧菌zj2003攻击,检测口服微球疫苗的免疫保护率。结果最适司盘-80添加量为2%～4%,壳聚糖包被浓度为0.6%～0.7%;优化的微球疫苗制备条件为：抗原蛋白浓度10 mg/ml,海藻酸钠浓度1.0%,水油比1∶2,搅拌速度2 000 r/min;微球疫苗的最佳冻干保护剂为2%甘露醇;以优化的条件制备的微球圆整性、分散性好,平均直径为（1.91±1.02）μm,表现出酸性条件稳定、中性和弱碱性条件溶胀的特性;微球疫苗口服免疫的大黄鱼对副溶血弧菌zj2003攻击表现出中等程度的保护力。结论制备了壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌ompK微球疫苗,并验证了其口服免疫的有效性,为鱼类口服弧菌疫苗的研制及应用奠定了基础。

弧菌外膜蛋白OmpK单克隆抗体的制备及其特性

制备弧菌外膜蛋白K(outer membrane protein K,Omp K)单克隆抗体并对其特性进行研究。以原核表达系统表达野生株Vibrio parahaemolyticus B的Omp K免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与肿瘤细胞SP2/0进行细胞融合,采用有限稀释法和间接酶联免疫吸附测定法筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,小鼠体内诱导制备腹水,用饱和硫酸铵沉淀法和亲和层析柱纯化抗体。最终获得能稳定分泌抗Omp K的两株单克隆抗体杂交瘤细胞株Omp K-Mab-4B7、Omp K-Mab-3C5,2株杂交瘤细胞系所分泌的Mab亚类均为Ig G1,效价达1∶128 000,抗体3C5、4B7的敏感度IC50分别为2.5、5.0μg/m L。Western blotting结果显示单克隆抗体可以与本实验室12株副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、ATCC17802、ATCC33847)的外膜蛋白有不同程度的结合反应,与4株溶藻弧菌中的3株(V.alginolyticus A、B、C)外膜蛋白能够较好的结合,与1株鳗弧菌(V.anguillarumMVM)外膜蛋白也有轻微的结合反应,实验制备的单克隆抗体可用于弧菌Omp K的基础研究和快速检测。

抗副溶血弧菌OMPK单克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测方法建立

制备全长和截短的弧菌外膜蛋白K(outer membrane protein K,OMPK),纯化后的OMPK免疫6~8周雌性BALB/c小鼠,间接夹心酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测小鼠的血清效价,结果表明全长OMPK重组蛋白制备的血清效价是截短OMPK1重组蛋白制备血清效价的128倍。通过全长的OMPK重组蛋白制备多株用于检测副溶血弧菌的单克隆抗体,用生物素(biotin)和辣根过氧化物酶对单克隆抗体进行标记。间接夹心ELISA实验结果表明:只有VP3-biotin和VP16-biotin与其他单克隆抗体配对检测不同的副溶血弧菌菌株表现出较高的灵敏度及良好的特异性,并且在检测其他种属20株菌时无交叉反应。VP16(Fab)-biotin/VP3检测副溶血弧菌时较VP16-biotin/VP3具有更高的灵敏度,该方法用于检测海鲜样品时,VP16-biotin/VP3检测三文鱼(5~10 CFU/25 g)和血蚶样品为副溶血弧菌阳性。本研究开发了一种快速、灵敏、简便的副溶血弧菌间接夹心ELISA检测方法。

利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌

目的:建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法。方法:首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,最后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序。结果:成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1~2μL的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号。测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合。通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌:副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测。结论:本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景。