隐式溶剂模型计算外重组能

使用隐式溶剂模型计算萘和全氟萘的空穴/电子外重组能,探讨了在有机材料电荷转移过程中,外重组能对于电荷载流子传输速率的重要影响,考虑到隐式溶剂模型的计算结果只依赖于介电常数的选取,因此其定量结果可能存在较大误差,但却能够给出定性结论。结果表明:外重组能随介电常数的减小而降低,同时外重组能与介电常数的倒数(1/ε)成比例关系;电荷传输材料的类型与空穴/电子外重组能之间可能存在某种对应关系,即p型传输材料的空穴外重组能大于电子,而n型传输材料的空穴外重组能却小于电子。

纤维蛋白原Bβ链变异基因的体外重组

目的:采用基因重组技术将可能与血栓形成有关的纤维蛋白原Bβ链羧基端的KGD结构置换为EGS结构,提供一种简单方便的构建变异克隆的方法。方法:在含有正常BβcDNA的pMLP质粒(简称p668)的溶液中,加入变异引物、筛选引物和dNTP。在T4聚合酶和T4连接酶的作用下,合成除变异碱基外,其他碱基均与原正常Bβ链互补的变异Bβ链,经过两次在不同菌系的大肠杆菌中的表达与筛选,获取变异克隆。结果:由于变异克隆引入了BstBI这个新的酶切位点,可通过电泳证实变异克隆构建的成功与否,本研究经电泳及DNA序列分析证实重组体确系已含变异EGS结构的克隆。结论:本方法为一构建变异克隆的分子生物学技术,可用于任何克隆的构建。本研究成功地获得了纤维蛋白原Bβ链羧基端KGD转换为EGS的变异体。

体外重组的人促黄体素对小鼠早期胚胎发育的影响

为了研究人的重组促黄体素 (r hLH)对小鼠早期胚胎发育的作用 ,我们用一定剂量的r hFSH (人促卵泡素 ,2 0IU)结合不同剂量的r hLH (0～ 2 0IU) ,或先与不同剂量r hLH配比 (5～ 2 0IU) ,再与一定剂量r hLH (15IU)结合 ,对性成熟前的小鼠进行超数排卵 ;并对从其输卵管冲出的早期胚胎进行体外培养 ,通过观察这些早期胚胎体外发育情况 ,再与PMSG hCG超排小鼠的早期胚胎体外培养结果进行比较。我们发现用重组激素处理的性成熟前小鼠 ,无论在平均冲胚数或桑囊率、囊胚率上 ,都以结合r hLH或配比r hLH的剂量为 15IU时最好 ,但各重组激素处理组在桑囊率和囊胚率上都极显著低于PMSG hCG对照组的相应指标。上述结果表明 ,r hLH对小鼠早期胚胎的发育 (尤其是囊胚的形成 )有明显的抑制作用 ,且与r hLH呈一定剂量依赖性关系。

藻红蓝蛋白α-亚基体外重组体系的优化

对我们建立的藻红蓝蛋白α-亚基体外重组体系进行了优化.实验表明:让表达的不具有组氨酸亲和标记的藻红蓝蛋白α-亚基连接/异构酶E亚基(简称PecE)与具有组氨酸亲和标记的藻红蓝蛋白α-亚基连接/异构酶F亚基(简称Histag-PecF)共同变性再复性,然后通过Ni2+金属鳌合亲和层析提纯PecE/Histag-PecF复合物,该PecE/Histag-PecF具有更好的催化活性.

重组PCR——一种快速体外基因重组技术

重组PCR是一种用于体外进行基因重组的简单、高效、快速技术 ,在基因重组过程中 ,不受载体和待连接DNA片段内部自身酶切位点的制约 ,连接时不依赖于限制性内切酶和连接酶 ,具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势。

真鲷肿瘤坏死因子（TNFα）基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中，并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选，并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后，进行序列测定。序列测定结果显示，该基因结构正确，且准确插入到表达载体启动子的下游，获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后，以SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果表明，该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整，在体外获得了高效表达的重组蛋白，高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示，随诱导时间的增加，重组蛋白产量逐渐增高，经4h诱导，其表达量可以达到平台期，过长时间的诱导，对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化，获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法，用Sephadex G150，对重组蛋白进行脱盐复性，使重组蛋白得到了进一步纯化。

利用体外特异位点重组反应构建黄瓜灰霉菌cDNA文库

体外特异位点重组技术应用于cDNA文库的构建,克服了传统文库构建方法中的常见问题。本研究利用这一技术,以能够分离得到植物激活蛋白的黄瓜灰霉菌(B.cinerea)菌株为材料,用TRIZOL试剂提取总RNA,从中分离纯化出mRNA,用预先接有attB2位点的Oligo(dT)引物和SuperScriptTMⅡ反转录酶合成cDNA,双链cDNA与attB1接头连接,经重组、转化后构建了其cDNA文库。文库滴度为2.3×106pfu/mL,文库总容量达2.53×107。随机挑取24个克隆,经酶切检测,平均插入片断为1466bp,重组率达100%。

论法庭外债务重组与法庭内重整的合理衔接

为了有效落实国家优化营商环境和加快完善市场主体退出机制的政策,最高人民法院倡导构建法庭外债务重组与法庭内重整的衔接机制。基于域外发展趋势及联合国《破产法立法指南》等国际文件对困境企业拯救二元机制的规定,结合中国语境下法庭外债务重组和法庭内重整的实践情况,通过揭示法庭外债务重组无法避免的“钳制”问题和有限约束的“效力”问题,分析法庭外债务重组和法庭内重整相通规则与内在关系,明确了对二者之间进行合理衔接的背景、原因和基础。同时,对二者之间进行合理衔接还需要对衔接程序和衔接制度做出立法安排,主要包括预重整路径选择和法律地位的确定,以及衔接主体和衔接效力等制度的设计。构建法庭外债务重组与法庭内重整的合理衔接机制,不仅可以提高对困境企业拯救的司法效率,也为正在进行的中国破产法修订和完善提供参考。

淋球菌mtrR调控区突变片段的体外重组和鉴定

目的:体外重组一段突变DNA片段,用其转染临床淋球菌株,产生特异位点-mtrR调控区突变的转染株。方法:采用基因剪接的技术,通过两步PCR反应完成DNA片段的体外定点突变,突变的EF片段用于后续淋球菌转染实验。结果:经重组的EF分子与淋球菌基因组DNA的相应片段并不完全匹配,测序结果显示,对应mtrR起始密码子上游第45位到第54位碱基之间有9 bp大小的片段缺失。结论:证实EF分子即为预期设计的突变DNA片段。

DNA分子体外重组实验教学的两种优选方案

DNA分子体外重组技术是基因工程的核心技术之一。国内许多高校在开设这一技术的实验教学中都采用了TA克隆法这一比较落后的实验方法。为了使学生更好地掌握DNA分子体外重组技术,增强技术的实用性,有必要在实验教学内容上作出调整。姊妹PCR克隆法和平末端克隆法是2种简单、经济、重复性好的克隆方法,其中姊妹PCR克隆法不需对目的基因进行酶切处理,即能得到具有各种黏性末端的DNA分子,可直接定向克隆到经相应内切酶消化的载体中。这2种方法不仅能够满足实验教学的需要,也适用于科研工作中各类载体的构建。

缺失金属原子簇的钼铁蛋白体外重组的研究进展

缺失金属原子簇的钼铁蛋白体外重组的研究进展汪志平，黄巨富，李佳格（中国科学院植物研究所，北京１０００４４）ＴＨＥＰＲＯＧＲＥＳＳＥＳＯＦＳＴＵＤＩＥＳＯＮＴＨＥＲＥＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮＯＦＭＥＴＡＬＬＯＣＬＵＳＴＥＲＳ－ＤＥＦＩＣＩＥＮＴＭＯＦＥ...

法庭外债务重组的优势与困境

对困境企业进行法庭外债务重组是由无力偿债的企业与其债权人之间通过协议的方式,对企业进行债务调整和资产重构,以实现企业复兴和债务清偿的一种再建型程序。其不同于破产重整的最大好处在于不受司法的直接控制,而以尊重当事人意思自治为原则,但因其本质上是当事人之间在民法框架下达成重组协议的过程,故不得不面临难以克服的弊端。

应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA

目的:利用体外DNA同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体。方法:在引物5'加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重组,转化并鉴定;将重组质粒转染293A细胞,免疫印迹鉴定目的基因的表达情况。结果:成功构建真核载体pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA,转染细胞后的表达产物相对分子质量分别是31×103和140×103。结论:与常规重组技术相比,体外DNA同源重组技术是一种高效的DNA重组方法,且不需考虑目的片段的限制性酶切位点。

电子转移反应中分子理论的溶剂自由能和外氛重组能

考虑到溶剂分子的非线性效应，应用Franck－Condon原理解释了外氛溶剂重组能；对电荷分离的反应，采用计算机模拟数据得到了一个合理的自由能计算模式，并用此模式计算了反应物和产物状态的重组能，结果表明，当能量差偏离平均值很远时，必须考虑自由能高次项的修正，即溶剂分子的非线性效应．对溶剂重组能效应的物理意义、反应物和产物状态之间重组能差别的原因进行了讨论．

藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基半胱氨酸的定点突变及体外重组研究

为研究藻蓝蛋白 (PC)和藻红蓝蛋白 (PEC) β亚基 (分别简称为 β PC、β PEC)生物合成、结构与功能的关系 ,用MegaprimerPCR定点突变技术设计 β PC、β PEC中与藻蓝胆素连接的第二个半胱氨酸的定点突变蛋白质 β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)。将相应的基因片段亚克隆于表达载体pET 30a,并转化大肠杆菌BL2l(DE3)。经IPTG诱导后 ,β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)在大肠杆菌中均得到了高效表达。β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)与藻蓝胆素的重组结果表明两个突变体的结构基本没发生改变 ,有利于对 β PC和 β PEC的生物合成进行进一步研究。

集胞藻PCC6803细菌光敏色素体外重组和光化学活性研究

采用聚合酶链式反应 (PCR)从集胞藻PCC680 3总DNA中扩增出细菌光敏色素全片段cph1及cph1(C 43 5) ,克隆于pBluescriptSK(+ ) ,然后插入表达载体pET3 0a进行高效表达。获得的脱辅基蛋白Cph1、Cph1(C 43 5)在合适的缓冲体系下分别与藻蓝胆素 (PCB)进行体外重组。光化学研究表明 ,两种脱辅基蛋白都能与PCB进行正确的重组 ,重组产物表现出 650～ 70 0nm可逆光致变色效应。锌电泳证实得到的细菌光敏色素辅基色素为PCB 。

人血管生长因子基因片段的体外重组

以互为模板的ＰＣＲ合成技术及克隆技术体外重组人血管生长因子基因片段（ｈＡｎｇｆ）并获得ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｈＡｎｇｆ重组体。方法：设计目的基因ｈＡｎｇｆ的上、下游引物。二引物以１８ ｈｐ区段互补，二引物的５’端分别具有加入的或利用简并密码设计的酶切位点，以ＰＣＲ合成目的基因前体，经ＥｃｏＲＩ作用，获目的基因。以ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ为克隆载体，目的基因插入该载体ＥｃｏＲＩ及ＥｃｏＲＶ之间。克隆后经Ｋｐｎｌ、Ｓｃａｌ及ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ作用，筛选并电泳定征。结果３以ＰＣＲ合成目的基因，并获ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｈＡｎｇｆ重组质粒。经克隆并定征，该重组体确含１３４ ｈｐ（含上游加入的酶切位点及起始密码子）的目的基因序列。结论：成功获得了 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｈＡｎｇｆ重组体，以作为进一步研究的基础。

重组骨脱细胞细外基复合Wistar大鼠成骨细胞体外培养的形态学观察

目的新型重组骨脱细胞细胞外基质(REAECM)的制备及其细胞相容性的初步检测,为骨组织工程寻找一种新型的细胞外支架提供实验依据。方法应用体外细胞培养技术,对鼠成骨细胞和REAECM体外进行联合培养1～4周,通过相差显微镜、光镜、电镜观察细胞在材料中的生长情况。结果成骨细胞可以在REAECM上发生良好的黏附、增殖,并且可以长入REAECM的孔隙内。结论REAECM可作为构建组织工程骨的一种较好的支架材料,具有网状孔隙结构;在体外和成骨细胞复合培养时表现出良好的细胞相容性,可以作为一种天然的骨组织替代材料。

染色体外同源重组结合细胞质注射途径研制转基因小鼠

以绵羊 β 乳球蛋白基因 (β Lactoglobulin ,β LG)为转基因表达框架 ,将人G CSF(HumanGranulocyteColonyStimulatingFactor,hG CSF)基因与报告基因 增强型绿色荧光蛋白 (EnhancedGreenFluorescenctProtein ,EGFP)基因作为双表达单元拼接到 β LG基因的第一外显子处 ,并在G CSF基因两侧引入同源重组位点loxP、lox2 2 72 ,将打靶基因表达构件 β LG hG CSF IRES EGFP(总长 9 3kb)分为两段进行构建 ,片段Ⅰ (长 5 9kb)与片段Ⅱ (长 5 6kb)两段重叠部分为 2 2kb。向小鼠受精卵细胞质共注射构件片段Ⅰ、Ⅱ和NLS(核定位信号 ) 3个基因片段。对仔鼠进行整合与表达的检测。PCR Southern杂交检测结果表明 ,片段Ⅰ的整合率为 6 2 3% (86 /138) ,片段Ⅱ的整合率为 5 4 3% (75 /138) ,片段Ⅰ、Ⅱ共整合 (包括两片段分别整合和染色体外同源重组两种情况 )的小鼠为 6 2只 ,整合率为 4 4 9% (6 2 /138) ,其中在双阳性转基因小鼠中发生染色体外同源重组的几率为 80 6 % (5 0 /6 2 )。RT PCR Southern检测了 10只发生染色体外同源重组的转基因雌性小鼠 ,hG CSF基因的表达率为 90 % (9/10 ) ,EGFP基因的表达率为 10 0 % (10 /10 ) ,通过对其乳汁紫外吸收光谱的检测 ,EGFP基因的表达率为 5 0 % (5 /10 )。

反向表达癌基因Ha-ras载体的体外重组

反义RNA是近年来研究基因表达调控的新领域,它可以特异性地抑制核苷酸顺序与之互补的RNA的表达。本实验利用DNA重组技术,将从胃癌细胞系BGC 823中克隆出的转化基因Ha-ras第一外显子及其5′端上游区反向重组入真核表达载体pECE的SV40启动子之后,此质粒具备在真核细胞中表达的所有条件,从而为进一步研究反义RNA对Ha-ras基因恶性功能的抑制作用打下基础。