苏云金芽孢杆菌高效菌株cry基因分析及多价基因组合的研究

对本室筛选的高活性Ｂ．ｔ．野生株进行了ｃｒｙ 基因检测，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明ｃｒｙＩＡｃ和ｃｒｙ１Ｃ位于质粒上．利用接合转移和电穿孔转化等方法对这些菌株进行了遗传改良研究．结果表明：高效野生株７４０４、ＨＤ－１－Ｘ和９５１０ 不易获得并表达外源ｃｒｙ 基因，而高效野生株Ｂｔｉ． ｔ－１８９７ 的电转化频率较高，并获得以Ｂｔｉｔ－１８９７ 为受体，对甜菜夜蛾、棉铃虫、黏虫和淡色库蚊均有毒力，具有ｃｒｙＩＡｃ、ｃｒｙＩＣ、ｃｒｙＩＶ及ｃｙｔ多价基因的广谱工程菌株．

获得多价转基因作物的策略

本文探讨了在利用植物基因工程技术的基础上，通过构建多基因或者多个表达载体，进行一次、多次基因转化或共转化方法获得转多价基因作物的一些策略，并进行了展望。

基因重组戊肝病毒多价复合抗原的表达及初步应用

目的 :利用基因工程技术体外表达高效 HEV多价复合抗原 ,建立一套敏感和特异的抗 HEV检测体系。方法 :将前期构建的基因重组戊肝病毒多价复合抗原表达质粒转化大肠埃希菌 JM10 9,筛选鉴定阳性克隆并进行诱导表达 ,表达产物经分子筛层析纯化后 ,利用 western blot作抗原特异性鉴定。以此抗原建立 EL ISA检测卫生部生物药品检定所 HEV血清参比品及临床血清标本 ,同时以 Genelab公司抗 HEVEL ISA试剂盒作为对照进行对比研究。结果 :重组质粒转化大肠埃希菌 JM10 9株后的阳性克隆 ,经诱导在SDS- PAGE中出现一条分子量大小约为 31.5 k D的蛋白条带 ,该蛋白纯化后经 Western Blotting检测证实为 HEV特异性抗原。以此抗原包被酶联板建立 EL ISA检测 5 3份国家卫生部标准 HEV参比血清 ,灵敏度达 10 0 % (38/38) ,特异度达 93.3% (14 /15 )。用此方法检测 6 8份临床标本 ,并与 Genelab EL ISA试剂盒结果比较 ,两者阴阳性相符的有 6 4份 ,总符合率为 94 .1%。结论 :本实验克隆表达的基因重组戊肝病毒多价复合抗原具有良好抗原性 ,以此抗原建立的抗 HEV EL ISA具有灵敏度高、特异性强的特点 。

伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建

对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNASphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化 ,将含gG全基因及其上游PK基因、下游gD基因部分编码区约 2 .6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中 ,获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP N1为模板 ,通过PCR扩增约 0 .3kb的SV40Poly(A)片段 ,并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点 ,利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有 9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点 ,在插入的同时导致gG基因 5’端编码区约 40 0bp的缺失 ,构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG Uni。序列分析进一步证实 :有 7个单一酶切位点可供外源基因直接插入。

表达马立克氏病病毒gI基因的重组鸡痘病毒的构建

以马立克氏病病毒 (MDV) 648株基因组DNA为模板 ,用PCR方法扩增 gI基因 ,将其插入到鸡痘病毒转移载体pFG1 1 75 1 ,通过脂质体方法转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,用蓝斑筛选方法纯化 4次 ,得到重组FPV ,用PCR方法证实 gI已插入到FPV基因组中 ,以间接免疫荧光试验鉴定重组FPV在CEF中表达了 gI基因 ,重组FPV命名为rFPVMDV648gI。

恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中免疫应答的初步研究

目的探索恶性疟复合多价ＤＮＡ疫苗的可行性。方法把带有ＡＴＧ的接头与人工合成的恶性疟原虫复合多价抗原基因ＡＢ相连后，构建分别带有ＳＶ４０或ＲＳＶ启动子的真核表达载体ｐＳＶ２／ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ，重组表达质粒经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，检测其诱发特异性体液和细胞免疫应答水平及毒副作用。结果ｐＳＶ２／ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后均诱发了一定水平的细胞及体液免疫应答，带ＲＳＶ启动子的ｐＲＥＰ９／ＡＢ免疫原性略强于带ＳＶ４０启动子的ｐＳＶ２／ＡＢ，ＤＮＡ免疫后未见明显的毒副作用。结论恶性疟复合多价ＤＮＡ疫苗可诱发特异的免疫应答。

肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原CS6和霍乱毒素B亚基在人伤寒沙门菌中的共表达及其免疫学效果观察

目的 :构建表达肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原基因CS6和霍乱毒素B亚基 (CTB)基因的细菌性腹泻基因工程多价疫苗。方法 :以基因工程减毒的人伤寒沙门菌为抗原载体 ,利用基于asd基因功能互补的宿主染色体_质粒平衡致死表达系统 ,实现了在没有抗生素选择压力的条件下 ,CS6和CTB在人伤寒沙门菌中的稳定表达。结果与结论 :检测结果表明 ,CS6和CTB的表达虽对宿主菌的生长有一定影响 ,但经过一段时间的培养 ,重组菌株仍可达到高密度生长。动物免疫结果显示 ,重组菌株在家兔体内均可诱生相应抗体 ,但从诱生的抗体效价、抗体持续时间方面评价 ,单独表达CS6与CTB的重组菌株的免疫学效果均好于两者共表达的重组菌株 ,提示在以后的疫苗研究实践中 ,可以考虑将分别表达CS6与CTB的重组菌株按一定比例混合 ,组成联合疫苗 ,用于细菌性腹泻的免疫预防。本研究结果对于细菌性腹泻基因工程多价疫苗的构建有指导意义。