口服幽门螺杆菌多价表位疫苗的构建及其免疫效果研究

目的构建口服幽门螺杆菌多价表位疫苗CTB-HapA-UreA-UreB-CagA(CTB-HUUC),并初步研究其在BABL/c小鼠体内的免疫治疗效果。方法文献查找幽门螺杆菌相关抗原的显性表位序列HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561、CagA149-164、CagA196-217,通过Linker将其串联,并在N端引入分子内佐剂CTB序列,构建重组质粒pET28a(+)/ctB-hpaA-ureA-ureB-cagA[pET28a(+)/ctB-HUUC]。再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG进行诱导表达、层析纯化,获得高纯度的CTB-HUUC重组蛋白,并采用Western Blot对其进行鉴定。GM1-ELISA检测重组蛋白CTB-HUUC体外结合GM1的能力。6周龄BABL/c小鼠,感染幽门螺杆菌1次/d,连续感染4次;末次感染后4周,灌胃CTB-HUUC重组蛋白200μg/次,1次/周,连续免疫4次。末次免疫后2周,处死小鼠,取小鼠胃组织进行幽门螺杆菌培养计数。结果成功获得高纯度的CTB-HUUC重组蛋白,Western blot检测CTB-HUUC可与抗幽门螺杆菌悉尼株(SS1株)小鼠血清及鼠抗CTB单抗产生特异性反应。GM1-ELISA检测重组蛋白CTB-HUUC体外可结合GM1,具有良好的佐剂活性。CTB-HUUC组小鼠胃组织进行幽门螺杆菌培养计数结果为6.14×10~3 CFU/g、CTB组为5.72×10~6 CFU/g、PBS组为6.70×10~6 CFU/g。结论口服幽门螺杆菌多价表位疫苗CTB-HUUC对感染幽门螺杆菌的BABL/c小鼠具有显著的治疗效果。

幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究

目的:利用生物信息学软件评价幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)多价表位疫苗CWAE的抗原结构,经原核表达获得高纯度CWAE蛋白,进而鉴定多价表位疫苗CWAE的免疫学性质。方法:通过生物信息学软件分析H. pylori多价表位疫苗CWAE的抗原结构;用人工合成的H. pylori多价表位肽融合基因WAE替换重组质粒pET28a-CUE中的UE基因,构建重组质粒pET28aCWAE。然后,将pET28a-CWAE转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化抗原蛋白CWAE;利用GM1-ELISA鉴定CWAE中CTB组分的黏膜免疫佐剂活性。最后,通过ELISA和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测CWAE激发BALB/c小鼠产生抗H.pylori抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的能力。结果:通过生物信息学软件证实H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的结构;重组表达质粒pET28a-CWAE经PCR、双酶切和基因测序鉴定,融合基因CWAE与设计序列完全一致;重组基因工程菌株pET28a-CWAE/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,抗原蛋白CWAE主要以包涵体形式存在,经Ni-NTP镍离子亲和层析纯化,纯度约达93. 2%;GM1-ELISA实验证实,CWAE中CTB组分依旧保持有较好的黏膜佐剂活性;ELISA结果证实CWAE能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体,而小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验进一步证实CWAE能够激发针对H. pylori多种致病因子的淋巴细胞免疫反应。结论:H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构,经原核表达可获得高纯度抗原蛋白,能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答。为研发防治H. pylori感染的多价表位疫苗奠定实验基础。

鸡球虫多价多表位亚单位疫苗免疫原性分析及抗球虫感染的效果观察

[目的]本试验旨在评估重组蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2作为亚单位疫苗候选抗原的潜力。[方法]应用PCR技术分别扩增NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1与NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2基因,用LaserGene分析基因编码蛋白序列特性;表达重组蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2,经Western blot分析重组蛋白的免疫原性,采用流式细胞术检测蛋白免疫后鸡脾脏中CD^(+)_(4)和CD^(+)_(8) T淋巴细胞的比值,经间接ELISA法检测鸡血清中细胞因子水平和特异性IgG水平以分析重组蛋白的免疫原性。取柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫新鲜卵囊经口感染免疫后的雏鸡,统计平均增重、病变计分、盲肠内容物卵囊数等指标,计算各组抗球虫指数(ACI),评估重组蛋白对球虫感染的免疫保护效果。[结果]LaserGene分析显示重组蛋白拥有密集且连续的T细胞表位,抗原指数高;Western blot分析显示重组蛋白可被4种艾美耳球虫的多克隆抗体识别,重组蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2均可提高机体CD^(+)_(4)/CD^(+)_(3)和CD^(+)_(8)/CD^(+)_(3)细胞比例,提高血清中IFN-γ、IL-4、IL^(-1)7、TGF-β和IgG抗体水平。以上结果表明重组蛋白具有良好的反应原性和球虫抗原性。免疫重组蛋白后试验组鸡平均增重高于对照组,卵囊产量下降明显,肠道病变程度减轻,抗球虫指数提升。[结论]重组蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2可作为多价多表位亚单位抗球虫疫苗的候选抗原。