日本血吸虫多价DNA疫苗pBK-Sj26 (Sj32)-Sj23免疫效果的观察

为了观察血吸虫病多价 DNA疫苗的保护力 ,将小鼠分成 5组 :空白对照组、空质粒对照组、单价抗原 DNA疫苗 p BK- CMV- Sj2 3组、多价抗原 DNA疫苗 p BK- CMV- Sj2 6- Sj2 3和 p BK- CMV- Sj3 2 - Sj2 3组。大量提取各组质粒 DNA后 ,各组于 0、 3、 5周在 BAL B/c小鼠股四头肌注射相应质粒 DNA,9周用血吸虫尾蚴攻击感染 ,15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率。结果显示 :与对照组比较 ,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性差异 ( P<0 .0 1) ;与单价 p BK- CMV-Sj2 3组比较 ,多价 DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性差异。提示血吸虫多价 DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价 DNA疫苗。

日本血吸虫多价DNA疫苗的构建

目的 构建日本血吸虫多价 DNA疫苗。 方法 在本室已构建的克隆载体 p Bluescript- Sj2 6、p Bluescript- Sj32及 p Bluescript- Sj2 3的基础上 ,根据 Sj2 6 k Da、Sj32 k Da和 Sj2 3k Da基因序列分别设计一对引物 ,且在引物中引入 1个含多肽接头甘氨酸 -甘氨酸 -丝氨酸 (G- G- S)的碱基序列。首先将 Sj2 3基因连接入载体 p BK中 ,构建重组质粒 p BK - Sj2 3,然后将 Sj2 6 k Da或 32 k Da基因分别连接入载体 p BK- Sj2 3中 ,构建成多价 DNA疫苗p BK- Sj2 6 - Sj2 3和 p BK- Sj32 - Sj2 3。对重组基因鉴定后 ,检测了质粒在小鼠肌肉中的表达情况。 结果 多价 DNA疫苗 p BK- Sj2 6 - Sj2 3和 p BK- Sj32 - Sj2 3转入了完整的 Sj2 6、Sj2 3和 Sj32基因。多价基因质粒能在小鼠肌肉组织中表达。结论 构建了日本血吸虫多价 DNA疫苗。

日本血吸虫多价DNA疫苗的构建及鉴定

目的构建含日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)基因和日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30H链CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6的多价DNA疫苗,并观察该融合基因在真核细胞中表达。方法设计合成连接肽(Gly4Ser)3基因的两条互补单链,退火成双链后克隆到真核表达载体pcDNA3.1,改建为pcDNA3.1-linker。分别将SjCTPIDNA片段及NP30的(CDR3)6DNA片段克隆到连接肽的上游或下游,构建pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6和pcD-NA3.1-(CDR3)6-linker-TPI2种多价疫苗。设计引物分别扩增TPI-linker-(CDR3)6和(CDR3)6-linker-TPI,再分别插入真核表达载体pEGFP-N1多克隆位点,绿色荧光蛋白基因的上游,重组质粒用脂质体导入真核细胞COS-7,观察插入基因在真核细胞的表达。结果经双酶切及测序鉴定证实多价疫苗pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI构建成功;构建的pEGFP-N1-TPI-linker-(CDR3)6和pEGFP-N1-(CDR3)6-linker-TPI在导入COS-7细胞后能成功表达。结论日本血吸虫TPI和NP30-(CDR3)6的多价DNA疫苗构建成功,且该融合基因能在真核细胞中表达。

口蹄疫病毒多价DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)多价DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法以复合多表位表达盒OAAT及AsiaⅠ型FMDV的P1-2A-3C基因为基础,构建FMDV多价DNA疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C,并用间接免疫荧光(IFA)方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。进一步进行小鼠免疫试验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,ELISPOT检测小鼠脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌水平,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群数量,淋巴细胞转化试验检测特异性淋巴细胞增殖水平。结果所构建的FMDV多价DNA疫苗在HeLa细胞中获得了正确表达。免疫小鼠后,血清特异性抗体水平、脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌、脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量及特异性淋巴细胞增殖水平均显著提高。结论已成功构建了FMDV多价DNA疫苗,并诱导小鼠产生了特异性的细胞免疫和体液免疫应答。

日本血吸虫多价DNA疫苗免疫保护作用的研究

目的研究日本血吸虫多价DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法65只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别肌肉注射纯化的质粒DNApcDNA3.1(对照组)、pcDNA3.1-TPI(TPI)、pcDNA3.1-(CDR3)6[(CDR3)6]、pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6(TLC)和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI(CLT),每鼠100μg。每隔2周加强免疫1次,共3次。末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a。末次免疫后2周取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果TPI、TLC组和CLT组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为1.71、2.71和4.70,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;TPI、TLC组和CLT组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4则无明显差异。多价DNA疫苗TLC组和CLT组减虫率分别达到37.30%、39.09%,减卵率分别为41.61%、49.54%,均显著高于TPI组和(CDR3)6组(P均<0.05)。结论多价DNA疫苗相对于单价DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较高的以Th1为主的免疫应答。

日本血吸虫Mr23000抗原与白细胞介素-12多价DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的研究能共同表达日本血吸虫Mr23000膜抗原(Sj23)与白细胞介素-12(IL-12)的多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23诱导BALB/c小鼠免疫保护作用。方法在多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23和PV-IL12的基础上,构建空白质粒PV和仅表达Sj23的质粒PV-Sj23。50只BALB/c小鼠分为5组,每组10只,分别注射多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23、表达Sj23的质粒PV-Sj23、表达IL-12质粒PV-IL12、空白质粒PV和生理盐水,100μg/只,免疫1次。4周后每只鼠攻击感染40±2条尾蚴,42d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵数。结果成功地构建了空白质粒PV和只表达Sj23的质粒PV-Sj23及多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23。PV-IL12-Sj23组和PV-Sj23组分别获得了45.5%和27.2%的减虫率,两组比较差异有显著性(P<0.05),减卵率分别为58.4%和33.9%。结论多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23可诱导BALB/c小鼠产生较显著的抗血吸虫免疫保护作用,且保护性效果比单价DNA疫苗PV-Sj23好。

Aβ_(1-15)多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果

【目的】构建Aβ1-15多价DNA疫苗,研究其诱导体液免疫的效果。【方法】基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段;在N端引物延伸加上IgGκ轻链信号肽序列;GSGGSGlinker再串连两段Aβ1-15二价基因片段,克隆入pcDNA3.1表达载体,构建pcDNA3.1-s4×Aβ15真核表达质粒;质粒转染COS-7细胞,Westernblot检测4×Aβ15的表达;质粒肌肉注射接种BALB/c鼠,共6次,18周加强免疫,ELISA法检测抗体效价以及抗体分型;免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗血清与转基因鼠Tg2576脑切片中老年斑的特异结合。【结果】测序证实所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15载体序列正确,在COS-7细胞中表达分子质量约8ku的分泌型4×Aβ15蛋白。pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗于第2次加强免疫后产生Aβ抗体,随加强免疫次数增多,抗体滴度增加,在19周,抗体平均滴度为1︰6400,抗体以IgG1型为主,且可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑免疫结合并被Aβ42肽抗原的中和。【结论】所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗可在小鼠体内产生高效价的Aβ抗体,为下一步免疫老年性痴呆转基因动物的研究提供条件。

日本血吸虫Sj23与IL-12多价DNA疫苗的构建

构建能共同表达日本血吸虫 2 3kDa膜抗原 (Sj2 3)与细胞因子IL 12的多价DNA疫苗 .RT PCR的方法从日本血吸虫成虫获得Sj2 3的基因片段 ,克隆到载体 pVIVO2 mIL12 /mcs上 ,进行酶切和测序鉴定 .采用免疫荧光的方法检测多价DNA疫苗 pVIVO2 Sj2 3 IL12在小鼠骨骼肌细胞的表达 .成功地构建了能共同表达日本血吸虫 2 3kDa膜抗原 (Sj2 3)与细胞因子IL 12的多价DNA疫苗 .此多价DNA疫苗在免疫小鼠肌细胞的细胞膜和细胞浆均获得了Sj2

恶性疟MSP-2、CSP多价DNA疫苗免疫小鼠应答类型研究

目的 探讨恶性疟原虫FCC -1/HN株裂殖子表面蛋白 -2 (MPS -2 )和环子孢子蛋白 (CSP)组成的DNA多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。 方法 将重组真核表达质粒pBK/CSP和pBK/MSP -2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经多价疫苗免疫 8wk后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELLSA法测定IFN -γ和IL -2的产生 ;用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化。 结果 与对照组相比 ,疫苗组CD4+ CD8+ T淋巴细胞有显著的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN -γ有一个高浓度的分泌。同时 ,免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应。 结论 恶性疟原虫FCC -1/HNpBK/MSP

日本血吸虫DNA多价疫苗pVIVO_2SjFABP-23的构建及其保护性免疫

目的构建日本血吸虫多价DNA疫苗pVIVO2SjFABP-23,并观察其在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法根据Sj FABP和Sj23的基因序列合成两对特异性引物,利用重组PCR技术将日本血吸虫Sj FABP和Sj23的基因片段进行拼接,得到融合基因SjFABP-23,再将该片段重组于p GEM-T载体中,进行PCR扩增及DNA序列测定。然后经双酶切将目的片段SjFABP-23克隆到pVIVO2的一个多克隆位点上转化E.coliGT 110获得重组质粒pVIVO2SjFABP-23,免疫小鼠进行免疫保护性实验。结果PCR扩增出一条大小约为1.1Kb的目的片段。免疫小鼠获得52.14%减虫率(P<0.01)和60.93%的减卵率(P<0.01),且均高于单价疫苗pVIVO2Sj23(P<0.05)。结论PCR成功扩增SjFABP-23的基因片段,血吸虫DNA多价疫苗pVI-VO2SjFABP-23构建成功,该疫苗在小鼠抗血吸虫感染中具有比单价疫苗pVIVO2Sj23更好的免疫保护作用。

日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3的构建及其保护性免疫研究

目的构建日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3,用以免疫小鼠,观察其在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法根据质粒pGEX-4T-1中SjGST-ORF和SjFABP基因序列,利用基因重组、PCR等技术将SjGST和SjFABP编码基因拼接在一起,得到融合基因SjGST-FABP,将融合基因SjGST-FABP定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA序列测定后,进行小鼠动物免疫和日本血吸虫尾蚴攻击感染及免疫保护性评价。结果成功构建了日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3。免疫小鼠获得42.39%的减虫率和56.09%肝减卵率(P<0.05)。结论日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3可诱导部分抗血吸虫尾蚴攻击感染的免疫保护效果,具有疫苗研究与开发价值。

日本血吸虫多价核酸疫苗的构建及免疫保护试验

利用PCR技术获得日本血吸虫GST抗原基因,通过分子克隆技术将GST、FABP基因克隆至pVAX1载体,并将其克隆至含有Sj23基因表达核的pIRESneo载体,构建重组质粒pVAX-GST、pVAX-GST-FABP、pIRESneo-Sj23和pIRESneo-GST-FABP-Sj23。将50只昆明小鼠随机分成5组,每组10只,分别以肌肉注射质粒pIRESneo-GST-FABP-Sj23、pIRESneo-Sj23、pVAX-GST、pVAX-GST-FABP和空白质粒pIRESneo,50μg/只,免疫2次,每次间隔21 d。测定小鼠免疫前后血清抗体水平,30 d经腹部皮肤感染血吸虫尾蚴,45 d后剖杀小鼠,计数各组小鼠虫卵数及成虫数。结果表明,重组质粒pVAX-GST、pIRESneo-Sj23、pVAX-GST-FABP和pIRESneo-GST-FABP-Sj23均能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体,pIRESneo-GST-FABP-Sj23免疫组所诱导的IgG水平最高;减虫率分别为26.1%、30.8%、33.2%和47.5%;减卵率分别为25.4%、45.0%、48.4%和69.8%。pIRESneo-GST-FABP-Sj23的减卵率和减虫率明显高于其他DNA疫苗。结果表明,日本血吸虫多价核酸疫苗能产生较强的免疫反应,并能获得较好的免疫保护效果。

牛分枝杆菌三价组合及融合DNA疫苗免疫效果的研究

分泌性蛋白Ag85B、MPB64和ESAT-6为Mycobacterium bovis的主要保护性抗原,在诱导机体免疫反应和抵抗感染中发挥重要作用。本研究以pcDNA3.1(+)为载体,构建了由上述3种抗原基因构成的不同疫苗:3基因融合(pcDNA-MPB64-Ag85B-ESAT-6,pCMAE)DNA疫苗和三价(pcDNA-Ag85B+pcDNA-MPB64+pcDNA-ESAT-6)DNA疫苗,评价各种DNA疫苗诱导的体液免疫、细胞免疫及以BCG攻毒后的免疫保护水平。试验结果表明,多基因融合DNA疫苗免疫后的小鼠血清抗体水平、淋巴细胞增殖(SI值)、gamma interferon(IFN-γ)和interleukin-2(IL-2)水平明显高于其他各组(P<0.05),攻毒保护效果也优于多价DNA疫苗,达到了BCG疫苗的免疫保护水平,表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的应用前景。

Sj31与鼠IFN-γ基因融合DNA疫苗免疫保护效果的研究

目的构建表达mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗,并探讨其免疫保护作用。方法在Sj31基因上游引物与mIFN-γ下游引物的5’分别设计与克隆载体相匹配的酶切位点,在mIFN-γ上游引物与Sj31基因下游引物的5’设计相同的酶切位点。分别进行PCR扩增,再通过引物的5’端相同的酶切位点进行2个PCR产物的酶切与连接,以连接产物为模板,应用Sj31的上游引物和mIFN-γ下游引物进行PCR扩增,将此次PCR产物经常规方法克隆入载体pcDNA3.0(简称为pc),构建成多价DNA疫苗pc-Sj31-mIFN-γ。对重组质粒鉴定后,大量制备纯化质粒免疫昆明小鼠,48只小鼠分为A、B、C、D4组,对照组的小鼠于股四头肌注射质粒pcDNA3.0100μg,3个免疫组的小鼠分别注射pc-Sj31、pc-mIFN-γ和pc-Sj31-mIFN-γ质粒DNA各100μg。在0、2、6周免疫共3次,第3次免疫后2周,每只小鼠经腹部贴片感染尾蚴40±1条,感染后第42天剖杀,计数各小鼠检获成虫数及肝卵数。结果pc-Sj31-mIFN-γ(D组)免疫组的减虫率和肝组织减卵率分别为28.56%和60.20%,但是表达鼠mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗并未明显优于单纯表达日本血吸虫组织蛋白酶B(Sj31)DNA疫苗的免疫保护作用。结论pc-Sj31-mIFN-γ多价DNA疫苗构建成功,但其诱导小鼠抗血吸虫病免疫保护效果不明显优于pc-Sj31。