多位点测序分型技术在病原微生物分型鉴定中的应用

多位点测序分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术是一种以核苷酸序列为基础的病原菌分型方法,它是高通量测序技术与成熟的群体遗传学相结合的产物。该方法简单易行,重复性强,可以通过国际互联网对某一致病菌株在全球范围内的传播分布情况进行追踪监控。目前,MLST技术已被广泛应用于原核病原菌及一些真核病原菌(如真菌)的分型鉴定中。主要对MLST技术的原理及其在一些常见病原菌分型鉴定中的应用进行了简要的阐述。

湘西黄牛粪源大肠埃希菌耐药性分析及多位点测序分型

为了解湘西黄牛粪源大肠埃希菌的耐药情况,从湘西黄牛主产区花垣县和凤凰县6个不同规模的湘西黄牛养殖场采集黄牛肛门拭子样品,用麦康凯培养基和大肠埃希菌特异性引物分离、鉴定大肠埃希菌;采用K–B法对分离的大肠埃希菌进行5类共18种常用抗菌药物的敏感性试验;利用超高通量荧光定量PCR对16株多重耐药大肠埃希菌的7类共22种耐药基因进行检测;用大肠埃希菌8个管家基因对此16株分离株进行多位点序列分型(MLST),并运用goeBURST程序和MEGA 7.0对其进行ST聚类分析和进化树分析。结果表明:从采集的206份黄牛肛门拭子样品中共分离、鉴定出大肠埃希菌170株;分离自各牛场的大肠埃希菌对四环素、多西环素、氨苄西林、复方新诺明和甲氧苄氨嘧啶的耐药性较高,耐药性最高的牛场对这5种抗菌药物的耐药率分别为29.63%、16.67%、22.22%、16.67%、33.33%,共有16株多重耐药菌,有8种耐药谱型;有acrA–01(100.00%)、fox5(81.25%)、sul1(68.75%)、sul2(75.00%)、folA(100.00%)、tetR–02(81.25%)、intI–1(clinic)(68.75%)和tnpA–01(50.00%)等6类8种耐药基因被检出;共获得11种ST型,其中,有9种新的ST型;16株分离株可分成2个克隆群和7个单独型;所有分离株聚集归为2个大群,分别为2个分支和7个分支。可见,湘西黄牛粪源大肠埃希菌的耐药性整体偏低,多重耐药菌主要出现于大型规模养殖场,且具有一定的复杂性,应加强对大型规模黄牛养殖场粪源大肠埃希菌耐药性的监控。

广西性病门诊患者泌尿生殖道沙眼衣原体株高分辨多位点测序分型研究

目的：了解广西性病门诊患者中泌尿生殖道沙眼衣原体型别分布，同时对随访患者沙眼衣原体的感染情况进行分析。方法在广西壮族自治区皮肤病防治所收集泌尿生殖道沙眼衣原体感染患者，采集男性尿道和女性宫颈拭子标本，并对初筛阳性患者在治疗完成后进行随访和标本采集，同时采集患者基本信息和临床信息。应用QIAxtractor全自动核酸纯化仪提取DNA，巢式PCR扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白基因（ompA）和MLST（高分辨多位点测序分型）所需的CT046（hctB）、CT058、CT144、CT172和CT682（pbpB）5个基因。对PCR产物进行序列测定，经序列比对和MLST型别分析获得菌株的ompA基因分型和型别，并用BioNumerics7软件对广西和意大利沙眼衣原体株绘制最小生成树。结果在44份来自初诊患者和6份来自随访患者的沙眼衣原体阳性样本中，42份成功进行沙眼衣原体ompA和MLST分型。共发现7种ompA基因型和15种hr-MLST分型的ST型别，其中有3种ST型别为首次报道。广西地区沙眼衣原体基因型别较意大利地区具有特征性。6例随访患者经分型方法鉴定3例为再次的新发感染，3例因未能成功进行基因分型而未能确诊。结论广西性病门诊患者感染的沙眼衣原体具有独特的型别，在随访中出现泌尿生殖道沙眼衣原体再感染病例。

广州市食品中蜡样芽胞杆菌生化分型和多位点测序分型分析

目的了解广州市食品中蜡样芽胞杆菌的生化分型、多位点测序分型(multilocus sequence type,MLST)情况和优势序列型。方法根据国标将79株食品来源蜡样芽孢杆菌进行生化分型,并根据PubMLST网站提供的蜡样芽胞杆菌MLST分型方案,扩增7个管家基因,经测序后,在PubMLST网站上比对获得菌株的序列型,利用eBURST V3和START2和MEGA6.0软件进行分析。结果广州市食品中的蜡样芽胞杆菌优势序列型为ST26,占16.46%。结论蜡样芽胞杆菌具有高度的遗传多样性。

下一代测序在白细胞抗原基因分型中的应用

白细胞抗原（HLA）基因位于人类第六号染色体的短臂6p21.31区,长3600 k,其多样性在器官移植和相关疾病方面扮演着重要的角色。随着聚合酶链反应（PCR）扩增技术和测序技术的应用,使HLA分型由血清学或细胞学阶段提升到分子生物学阶段。经过数十年的发展,科学家一直努力应对HLA群体大量的和不断扩大的等位基因（截止到2015年1月已有12542个HLA等位基因）。

基于高通道测序的肠道菌群与冠心病的相关性研究

背景冠心病是发达国家及发展中国家最常见的死亡原因之一,肠道菌群的组成在冠心病的病理过程中起重要作用,越来越多证据表明,肠道菌群失调可导致脂质代谢紊乱、低度炎性反应、胰岛素抵抗、血压升高等,进而增加冠心病风险。目的通过检测冠心病患者肠道菌群结构及多样性,了解其肠道菌群特点,进一步寻找冠心病危险因素,为冠心病患者提供新的诊疗方法。方法选取2016年7月-2017年6月入住新乡医学院第一附属医院心血管内科及心脏重症监护病房(CCU)的冠心病患者62例,应用Gensini评分将其分为轻度组27例,中重度组35例;同时选取同期于本院体检的30例健康者作为对照组。采集研究对象的粪便样本,提取粪便样本的DNA并对其进行细菌16S rDNA V3区的聚合酶链式反应(PCR)扩增,对最终的PCR扩增产物进行生物信息学分析。结果三组原始PE reads数目(PE_reads)、去除嵌合体后有效序列数目(Nochimera)、有效序列平均长度(AvgLen)、有效数据的GC百分比含量(GC)、Nochimera与PE_reads的百分比(Effective)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。三组ACE、Chao1、Shannon、Simpson指数比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中,轻度组与中重度组ACE、Chao1、Shannon、Simpson指数均低于对照组(P<0.05)。三组拟杆菌门、变形菌门相对丰度比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中中重度组拟杆菌门相对丰度低于对照组,变形菌门相对丰度高于对照组(P<0.05);三组拟杆菌纲、梭菌纲相对丰度比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中中重度组拟杆菌纲相对丰度低于轻度组、梭菌纲相对丰度高于轻度组,轻度组拟杆菌纲相对丰度低于对照组、梭菌纲相对丰度高于对照组(P<0.05);三组拟杆菌属相对丰度比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中中重度组相对丰度低于轻度组和对照组,轻度组相对丰度低于对照组(P<0.05)。Metastats差异分析结果显示对照组与轻度组拟杆菌属、巴斯德菌属、脱磷弧菌属、埃希杆菌-志贺杆菌属、考拉杆菌属菌落相对丰度比较,差异均有统计学意义(P<0.05);对照组与中重度组巴斯德菌属、Dialister属、黄杆菌属、Parasutterella属、考拉杆菌属菌落相对丰度比较,差异均有统计学意义(P<0.05);轻度组与中重度组脱磷弧菌属、Dialister属、埃希杆菌-志贺杆菌属、黄杆菌属、帕拉普菌属菌落相对丰度比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论肠道菌群多样性、结构的改变,是冠心病的危险因素,因此调节肠道菌群、粪菌移植等方法可能成为冠心病新的治疗方法。

马西利亚分枝杆菌临床分离株的多位点序列鉴定和药物敏感性试验分析

目的对单基因比对不能区分的马西利亚分枝杆菌（M．massiliense）临床分离株进行菌种鉴定，补充其药物敏感谱，为临床诊治提供依据。方法2013年中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室共收集了47例疑似非结核分枝杆菌（NTM）感染的临床样本，用对硝基苯甲酸、噻吩-2-羧酸肼培养基和多位点PCR方法区分鉴别得到的分枝杆菌，采用基因序列比对进行NTM菌种鉴定，其中未能准确鉴定菌种的6株临床分离株进一步通过多位点序列分析（ML-SA）方法进行定种鉴定。采用微孔板阿尔玛蓝测定法（MABA）对马西利亚分枝杆菌菌株开展36种药物的药物敏感性试验（简称“药敏试验“）。结果47例临床样本中鉴定出34株NTM，其中6株临床分离株综合5个管家基因（16SrRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA）的单基因比对结果仍不能鉴定菌种，因此本研究采用MLSA方法构建邻位相加法进化树确认6株均为马西利亚分枝杆菌。药敏试验结果显示M．massiliense对阿米卡星为敏感（16μg／ml）或中度敏感（32μg／ml），对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、环丙沙星、乙硫异烟胺、卷曲霉素、对氨基水杨酸、氧氟沙星、卡那霉素、环丝氨酸、美罗培南、米诺环素12种药物耐药。结论MLSA方法能有效鉴定马西利亚分枝杆菌；马西利亚分枝杆菌耐药程度较高。

稽留流产绒毛染色体通量测序技术检测235例结果分析

目的探究染色体异常类型与年龄、妊娠方式及既往流产次数之间的关系。方法回顾性分析2018年8月至2019年8月西北妇女儿童医院因稽留流产行高通量测序技术检测绒毛染色体的病人235例,对其结果进行细分比较、统计分析。结果235例稽留流产病人绒毛染色体中,异常染色体有165例(70.21%),其中染色体数目异常占50.2%(118/235),并以三体为主占46.7%(77/118),且16-三体最为高发;染色体结构异常中,已知致病性的基因拷贝数高于未知致病及多态性。染色体正常组年龄(30.19±3.62)较异常组年龄(32.08±4.52)偏低(t=-3.11,P<0.05),且年龄≥35岁组的染色体异常率(83.92%)明显高于<35岁组(65.92%)(χ^(2)=6.61,P<0.05),且双重三体组年龄明显高于三体组(P<0.05);妊娠方式及流产次数对染色体异常发生率无明显影响(P>0.05)。结论早期流产的病因以染色体异常为主,年龄是影响胚胎染色体的重要因素,而妊娠方式及既往流产次数并未见明显影响作用。高通量基因测序技术染色体检测方法可明显增加染色体的异常检出率,更加准确地为明确稽留流产病因提供理论依据,继而可更好地指导下一次优良妊娠。

广州地区老年人肺炎链球菌临床分离株的青霉素耐药研究与分子分型

目的调查广州地区老年患者肺炎链球菌分离株对青霉素的敏感性,并分析其亲缘关系。方法K-B纸片法对33株分离自老年住院病人的肺炎链球菌进行青霉素药敏试验;应用PCR技术检测青霉素结合蛋白基因pbp1a,pbp2x,pbp2b;用盒式PCR(BOX-PCR)分析菌株间亲缘关系。用多位点测序分型技术(multilocus sequence typing,MLST)检测青霉素耐药菌株的分子分型。结果青霉素的耐药率为3.03%(1/33);用PCR方法鉴定PSSP的准确率为68.75%;BOX-PCR可将这33株肺炎链球菌分为21型。MLST分型显示,青霉素耐药菌株属ST271型。结论广州地区老年患者肺炎链球菌对青霉素耐药率较低,用PCR方法检测PSSP有一定的可行性。BOX-PCR显示了较高的分辨率,能快速可靠地检测菌株间的亲缘关系。广州地区流行的耐药克隆与Taiwan19F-14株同源。

黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白编码序列第14和16外显子中单核苷酸多态性研究

背景与目的单核苷酸多态性(SNPs)在蛋白编码序列中多以富集成簇的方式分布,并提示其可能有民族区域和人种之间的差异性,然而SNPs在黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白(prepro EGF)编码序列第14和16外显子中的分布状况迄今尚未见报道,本研究拟对35例黔西南汉族受试者进行研究,旨在分析SNPs在prepro EGF编码序列第14和16外显子中的分布特征。方法设计合成4条引物,分别对35例汉族受试者prepro EGF编码序列第14和16外显子区段进行PCR扩增和产物的DNA测序;检索单核苷酸多态性资料库(db SNP)获取资料并与测序结果进行对比分析。结果 35例黔西南汉族受试者中13例(37.1%)在prepro EGF编码序列的2 525 bp位点出现SNPs,基因型为AG和GG,频率分别为69.2%和30.8%,其等位基因频率分别为A 34.6%和G 65.4%;27例(77.1%)在2 576 bp位点有SNPs,基因型为AA和AG,频率分别为66.7%和33.3%,等位基因频率分别为A 83.3%和G 16.7%。相比之下,北京汉族受试者较黔西南汉族受试者在prepro EGF编码序列第14外显子内多了1个单核苷酸多态位点,即2 619 bp位点;欧美等其他民族不仅在prepro EGF编码序列第14外显子内分布有rs199935855等7个SNPs,而且在其第16外显子内也分布有rs149396988等6个SNPs;黔西南汉族和北京汉族受试者在prepro EGF编码序列的第16外显子内均未见有SNPs分布。结论在黔西南汉族、北京汉族和欧美等民族的prepro EGF编码序列第14和16外显子中,SNPs分别具有各民族、各种族的特征性分布,据此可区分不同地域的种族和人群,甚至进行个体识别。也可将这些呈特征性分布的SNPs视为遗传标记进而深入研究SNPs与疾病发生的关系。

金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性及ST分型特点分析

目的:分析本地区金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性及ST分型特点,揭示金黄色葡萄球菌在本地区的临床规律。方法:收集深圳大学南山医院2010-2015年临床分离金黄色葡萄球菌,其中138株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),190株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)。经BD phonixtm 100公司全自动药敏鉴定系统及琼脂稀释法测定其药敏,聚合酶链式反应(PCR)方法检测其管家基因进行多位点测序分型(MLST)分型,并分析其药敏与MLST的关系。结果:328株金黄色葡萄球菌标本主要来源于痰液、咽拭子、气管分泌物、血液、伤口拭子和脓液,MRSA的检出率为42.07%,阿米卡星、红霉素、环丙沙星、四环素、妥布霉素的耐药率分别为48.12%、95.62%、50.37%、65.94%、50.37%,MLST主要流行型别为ST239、ST59、ST1。MSSA红霉素、四环素、妥布霉素的耐药率分别为73.65%、40.42%、40.11%,主要型别为ST7、ST59、ST398、ST188。无万古霉素,利奈唑胺,替加环素,替考拉宁耐药株。结论:本地区金黄色葡萄球菌的标本来源于呼吸系统,MRSA对呋喃妥因,奎奴普汀,利福平敏感,MSSA对呋喃妥因,奎奴普汀,利福平,阿卡米星,环丙沙星敏感,ST239–MRSA、ST7–MSSA、ST398–MSSA、ST88–MSSA、ST120–MSSA多重耐药(3种或3种抗菌药物以上耐药)。

牛源金黄色葡萄球菌耐药性及甲氧西林敏感和耐甲氧西林菌株演化相关性研究

为研究牛源金黄色葡萄球菌耐药性以及甲氧西林敏感(MSSA)和耐甲氧西林(MRSA)菌携带的耐药基因、MRSA的SCCmec基因型,揭示牛源MSSA与MRSA之间的演化相关性和MRSA起源和扩散途径,对2009年以来中国五省区不同牛场分离的54株金黄色葡萄球菌进行了药敏试验。对确定的12株MSSA和MRSA进行了耐药基因检测、SCCmec基因型分型和多位点测序分型(MLST)研究。54株菌的药敏结果显示,对红霉素、克林霉素、青霉素、复方新诺明、多西环素、四环素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素的耐药菌株分别为88.8%、81.5%、88.9%、90.7%、92.6%、94.4%、79.6%、63.0%和70.4%。其中,对所测10种抗生素完全耐药的占5.6%,对5种以上耐药的占85.2%,6株(11.1%)对头孢西丁耐药。12株MSSA和MRSA菌株的药敏和耐药基因检测结果显示,3株MRSA对10种抗生素耐药;6株MSSA菌中,新疆分离株对2～4种抗生素耐药,其它省区分离株对7种以上抗菌素耐药。12株MSSA和MRSA菌均检出ermC和tetK基因;6株MRSA中均检出aac(6′)/aph(2″)基因,5株检出tetM基因,4株检出aph(3′)-Ⅲ基因;6株MSSA均未检出aac(6′)/aph(2″)和aph(3′)-Ⅲ,4株检出tetM基因。用多重PCR对MRSA进行SCCmec基因分型显示,5株为SCCmec IV,1株未能分型;12株菌的MLST分型发现,所有菌株分为ST50、ST965、ST6、ST97和ST9序列型。经eBURST v3分析,MRSA分布在CC7、CC4、CC21和CC9四个克隆复合群(CCs)中,MSSA分布在CC7和CC32克隆复合群中。以上研究表明,我国牛源金黄色葡萄球菌不仅耐药严重,且表现多重耐药;MRSA基因型以SCCmec IV为主。对牛源SCCmec IV型MRSA与同型人源MRSA的耐药谱分析发现有较大差异,推测位于质粒或转座子上的耐药基因可能插入到金黄色葡萄球菌基因组中,导致耐药基因在不同菌株间传播。根据ST97中有MSSA和MRSA以及牛源MRSA与人源MRSA的MLST比较,确认我国牛源MRSA是在抗生素的选择压力下由来源于不同克隆复合群的MSSA获得SCCmecIV而产生,推测同一克隆株MRSA的扩散并不是MRSA大范围出现的主要原因。

D1/D2、MLST及MALDI-TOF MS在新生隐球菌分类中的应用

目的:比较单一D1/D2区域测定、多位点测序分型技术(MLST)和基质辅助激光解吸-飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)在新生隐球菌(Cryptococcus podzolicus)及与之邻近的其他种属的分类研究的稳定性和可靠性。方法:挑选以Cryptococcus podzolicus为主及与之相邻的其他种和属的菌株共20株及1株outgroup模式菌株,运用酵母菌基因组提取试剂盒提取其DNA,PCR扩增5个管家基因(ITS,D1/D2,rpb1,rpb2,tef1)并测序,以Bayesian法(Mr Bayes3.2.1)、最大似然法、邻接法(MEGA 6.0软件)分别构建5个管家基因及D1/D2基因序列的系统发育树;应用MALDI-TOF-MS采集蛋白指纹图谱,在Bruker Daltonics数据库(BDAL)和CBS真菌保藏中心数据库信息的基础上,对20株菌进行聚类分型,构建聚类分型树状图。结果:3种方法所得树状图在种间的层面上,均出现了a、b、c 3个分支;在种内的层面上,特别是a这一分支,均为Cryptococcus podzolicus,单一D1/D2区域所构建的系统发育树分化程度不大,各菌株间无明显的分类多样性,而MLST及MALDI-TOF MS所得到的树状图在种内均出现了明显的分类多样性及亲缘关系的差异性。结论:MLST及MALDI-TOF MS均可作为隐球菌属中菌株分类鉴别中有效的分子生物学方法,能可靠地揭示隐球菌属中各菌种的种间及种内的遗传进化关系,MALDI-TOF-MS比MLST则更为快捷准确。

二代测序技术应用于家族性非髓样甲状腺癌易感基因筛查

目的利用二代测序技术筛查非髓样甲状腺癌（NMTC）的遗传易感基因。方法收集家族性非髓样甲状腺癌（FNMTC）和散发性非髓样甲状腺癌（SNMTC）患者的外周血，提取DNA。针对遗传性甲状腺癌相关基因的全外显子区域进行探针杂交捕获测序，筛查基因突变位点。结果在63例NMTC样本中，共发现分别位于13个基因的45个高质量的胚系突变。其中在47例FNMTC患者中发现37个突变，在16例SNMTC患者中发现8个突变。在8个FNMTC家系中，发现同一家系的患者携带相同的突变位点。在47例FNMTC患者中，基因突变携带者29例；16例SNMTC患者中，基因突变携带者6例，差异无统计学意义（P=0．092）。FNMTC患者中，基因突变组（29例）和基因未突变组（16例）中中央区淋巴结转移患者分别为22例和7例，差异有统计学意义（P=0．031）。在具有亲子关系的患者中，7例亲代患者中，有中央区淋巴结转移3例：9例子代患者均有中央区淋巴结转移，差异有统计学意义（P=0．019）。结论二代测序技术可用于筛查FNMTC患者特异性的遗传易感基因变异。有助于早期发现FNMTC患者和预测甲状腺癌患者家族成员的发病风险。

外显子组测序在皮肤肿瘤中的研究进展

皮肤肿瘤发病率有逐年上升趋势,环境因素和遗传易感性是皮肤肿瘤的主要致病因素.基因突变与皮肤肿瘤的发生、发展密切相关,为阐明皮肤肿瘤的发病机制提供线索.在黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、皮肤基底细胞癌等皮肤肿瘤中,已发现众多新的突变基因.外显子组测序作为筛查易感基因的有效平台,覆盖率深、数据准确性高,可以检测皮肤肿瘤及其他多种疾病的致病基因和新的候选基因,对皮肤肿瘤的诊断、治疗及预后判断有重要意义.

一个甲基丙二酸血症家庭的MUT基因突变研究

目的检测甲基丙二酸血症(MMA)病儿父母的甲基丙二酰辅酶A变位酶(MUT)基因突变类型。方法采用全基因组外显子测序技术(WES)对1例单纯性MMA病儿父母MUT基因进行检测。结果病儿父亲MUT基因发生了错义突变(c.1106G>A),导致p.Arg369His;病儿母亲MUT基因发生了框移突变(c.2075_2081),导致p.Leu692ArgfsX11。结论病儿父母均为MMA携带者。

β型甲状腺激素抵抗综合征患者临床特点分析

背景β型甲状腺激素抵抗综合征(RTHβ)属于罕见内分泌疾病,临床极易误诊、误治。目的总结RTHβ患者的临床特点,为临床医师了解本病提供帮助。方法选取2013—2016年于中国医科大学附属第一医院内分泌与代谢病科诊断为RTHβ的患者6例。回顾性分析6例RTHβ患者的临床资料,包括性别、诊断年龄、发病年龄、家族史、主诉、心电图检查结果、甲状腺触诊结果、甲状腺超声检查结果、甲状腺核素静态显像结果、甲状腺功能指标〔游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)〕、促甲状腺素受体抗体(TRAb)、性激素结合蛋白(SHBG)、血清铁蛋白、脂代谢指标、骨代谢指标、骨密度、基因测序情况等。结果6例RTHβ患者的诊断年龄均高于发病年龄,患者在确诊RTHβ之前均被误诊为甲状腺功能亢进症,长期服用抗甲状腺药物治疗。患者主诉均存在心悸、多汗,3例伴心房颤动。6例患者甲状腺核素静态显像均显示甲状腺双叶摄取率增高。5例RTHβ患者甲状腺超声显示有甲状腺肿大,4例显示多发结节。6例RTHβ患者血清FT3、FT4水平升高,TSH水平在参考范围,且TRAb均为阴性;血清SHBG和血清铁蛋白均在参考范围;甲状腺激素受体(TR)β基因测序均存在点突变。结论RTHβ的临床表现存在高度异质性,临床诊断时需注意与甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症区分,同时注意并非所有的RTHβ患者能检测出TRβ基因突变。对于高度怀疑为RTHβ的患者,可以采用促甲状腺素释放激素(TRH)兴奋试验、左旋-三碘甲腺原氨酸(L-T3)抑制试验或TRH兴奋试验联合L-T3抑制试验进行临床诊断。

万古霉素非敏感肠球菌的筛选和基因型分析

目的对实验室保存的325株肠球菌进行万古霉素非敏感肠球菌筛选,并对筛选出的菌株进行耐药表型、耐药基因型、菌株同源性分析。方法采用琼脂平皿二倍稀释法筛选万古霉素非敏感肠球菌,并检测菌株对替考拉宁的敏感性;采用PCR方法检测万古霉素非敏感肠球菌的耐药基因型;通过肠道细菌基因间重复一致序列(ERIC)PCR技术、脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术、多位点序列分型(MLST)技术进行菌株的同源性分析。结果从325株临床分离肠球菌中共筛选出17株万古霉素非敏感肠球菌,包括1株粪肠球菌、11株屎肠球菌和5株鹑鸡肠球菌。其中1株粪肠球菌和11株屎肠球菌对万古霉素显示高水平耐药,对替考拉宁耐药或中介耐药,PCR检测结果显示van A型;5株鹑鸡肠球菌对万古霉素中介耐药,对替考拉宁敏感,PCR检测结果显示van C1型。ERIC同源性分析显示同基因型的大多数菌株显示相似的分型;PFGE同源性分析显示,17株临床万古霉素非敏感肠球菌分型不同,不属于单克隆流行播散;MLST同源性分析显示,1株临床万古霉素非敏感粪肠球菌属于ST4,11株临床万古霉素非敏感屎肠球菌共分为6个ST型,其中4株属于ST78,是屎肠球菌出现频率最高的ST型。结论我国万古霉素耐药菌在粪肠球菌中分离率较低,但屎肠球菌中万古霉素耐药情况较严重,并且耐药菌株携带易于传播和转移的van A基因。同源性分析结果显示万古霉素耐药存在同源性传播的可能性。

B族链球菌规律成簇间隔短回文重复序列与基因分型及耐药基因的关系

目的:探讨孕晚期孕妇生殖道定植及侵袭性感染患儿的B族链球菌(group B Streptococcus,GBS)规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)分布及其与多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、耐药基因的关系。方法:回顾性收集2017年1月至2022年1月山西医科大学附属儿童医院(山西省妇幼保健院)收治的孕晚期孕妇定植GBS及GBS侵袭性感染患儿临床分离的84株GBS菌株(包括侵袭性菌株17株、定植菌株67株),检测其CRISPR、MLST、耐药表型及耐药基因。采用χ^(2)检验或Fisher精确概率法进行统计分析,并采用MEGA11构建发育树图。结果:84株中共有10种ST型别,最常见的是ST10(46.4%)。GBS对青霉素敏感,对红霉素和克林霉素的耐药率分别为75.0%和73.8%;17株GBS侵袭性菌株中,ST10型对红霉素、克林霉素以及左氧氟沙星耐药率达100%。62株检出CRISPR1基因,阳性率为73.8%;CRISPR1阳性菌株中ST10占比显著高于CRISPR1阴性菌株[56.5%(35/62)与18.2%(4/22),χ^(2)=9.56,P=0.002];CRISPR1阳性菌株中检出ermB、gyrA、parC比例明显高于阴性菌株[分别为54.8%(34/62)与22.7%(5/22)、67.7%(42/62)与36.4%(8/22)及71.0%(44/62)与36.4%(8/22),χ^(2)值分别为6.73、6.64及8.25,P值均<0.05],而ermA的比例低于阴性菌株[6.5%(4/62)与31.8%(7/22),χ^(2)=7.09,P=0.008]。结论:ST10是孕妇生殖道定植GBS及婴儿侵袭性GBS感染的主要基因型;GBS对青霉素敏感;在CRISPR1阳性菌株中ST10型GBS占优势;CRISPR1与部分耐药基因的传播相关。

耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌耐药基因研究

目的了解对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)碳青霉烯酶基因的携带情况。方法收集本院2013年1月至2016年6月临床标本中分离的630株肺炎克雷伯菌,采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统进行细菌鉴定和药敏检测以及改良Hodge试验筛选CRKP,采用聚合酶链反应(PCR)检测碳青霉烯酶基因,采用多位点序列分型(MLST)技术对CRPK进行分子遗传学分析。结果 630株肺炎克雷伯菌中,61株对亚胺培南耐药,为CRKP,占9.7%,CRKP对多种临床常用抗菌药物均显著耐药,对替加环素具有良好的敏感性。PCR结果显示59株CRKP携带碳青霉烯酶基因,其中53株携带bla KPC-2型基因(89.8%),4株携带bla NDM-1型基因(6.8%),2株携带bla OXA-48型基因(3.4%)。MLST分型主要以ST11为主(49株,80.3%)。结论我院CRKP基因型主要为KPC-2型,另外有散在NDM-1和OXA-48型,MLST分型主要为ST11型。