利用优化的反向PCR策略高效构建多位点突变体

蛋白质的突变体是研究其结构和功能的基础,文中旨在建立一种高效、快捷的多位点突变体构建方法。当要突变4个及以上相邻的氨基酸残基时,设计两长两短(长引物Ⅰ/Ⅰ、短引物Ⅱ/Ⅱ) 4条引物:长引物包含突变位点,且突变碱基数≤20 bp,短引物不包含突变位点;两条引物的GC含量≤80%、退火温度之差≤40℃,分别以Ⅰ/Ⅱ和Ⅰ/Ⅱ两对引物和模板进行两组反向PCR扩增。扩增后各体系均可得到含有突变位点的非甲基化线性质粒,且以Ⅰ/Ⅱ和Ⅰ/Ⅱ为引物扩增得到的两组线性质粒的断开位点分布在突变位点两侧。用DpnⅠ酶切回收后等摩尔比混合的PCR产物除去甲基化模板,再进行一轮变性和退火处理,两组线性质粒在95℃变性后互相以来自对方的单链DNA为模板退火形成开环质粒,转化大肠杆菌感受态细胞即可得到包含突变位点的转化子。结果表明,该方法可同时突变4–11个连续氨基酸残基(8–20 bp,将大幅简化多位点突变体的构建,从而进一步提高蛋白质结构和功能研究的效率。