一种改进的简单快速的多位点突变方法

为了在 1个基因序列内同时实现多个位点突变 ,本试验以犬 2型腺病毒 E3区为突变目的基因 ,建立了一种以多个引物多聚酶链式反应为基础的简单快速的多位点突变方法。首先根据需要在 E3区不同位置设计了与同一条链互补的 4条突变引物 ,在 4条引物 (PBGL、PNCO、PBST、PNOT)中分别引入了 Bgl 、Nco 、Bst B 和 Not 位点 ,与模板链核苷酸序列相比 ,每条引物内均包含了 2～ 3个突变的碱基 ;然后以含 CAV- 2 E3区基因的质粒为模板 ,利用高保真 DNA聚合酶、d NTPs和 5′末端磷酸化的 4条引物 ,在同一个 PCR反应管内进行突变 PCR反应 ,最后以 Dpn 消化反应管内模板链 ,取少许电激转化 E.coli DH10 B感受态细胞获得转化子。经上述 4种内切酶对转化子 DNA的酶切鉴定 ,证明获得了存在多种突变组合的突变基因 ,为进一步研究 E3区不同缺失对外源基因表达的影响奠定了基础 。