基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。

位于CD36基因剪切位点的2个新突变及其导致CD36缺失的分子基础

目的:对在广西人群中发现的2个位于CD36剪切位点的新基因突变,以及它们导致CD36缺失的分子基础和在人群中的发生率进行研究。方法:对在广西人群中发现的2例CD36缺失个体(HHC和WGM)使用DNA测序和cDNA克隆测序,检测他们的CD36外显子序列及mRNA蛋白编码区序列,对所发现的CD36 mRNA异常转录本建立真核表达细胞株并用Western blot实验验证异常转录本对CD36表达的影响。对所发现的新突变基因建立DNA PCR-SSP基因分型方法,在广西地区的110名CD36缺失个体群和广西地区随机的296名人群间展开人群分布调查。结果:在HHC和WGM个体中,发现了CD36剪切位点新突变CD36 c.430-1G>C,且在WGM个体中还发现了CD36 c.1006+2T>G的剪切位点新突变。cDNA克隆测序显示,CD36 c.430-1G>C可导致c.429_430ins[430-17_430-2;C](p.Ala144fsTer1)和c.430_609del(p.Ala144_Pro203del,GenBank注册号:HM217023.1)2种CD36 mRNA异常转录本的产生,而CD36 c.1006+2T>G可导致c.819_1006del(p.Ser274GlufsTer16)(GenBank注册号:HM217025.1)CD36 mRNA异常转录本的产生。通过建立的真核表达细胞株及Western blot实验验证了以上3种异常转录本均可导致CD36表达缺失。对所发现的2个剪切位点突变基因展开的人群发生率的研究显示,在110名CD36缺失个体群和随机的296名人群中,CD36 c.430-1G>C突变发生率分别为10.91%(12/110)和1.35%(4/296),而CD36 c.1006+2T>G突变的发生率分别为2.73%(3/110)和0(0/296)。结论:本研究发现了2个位于CD36基因剪切位点的新突变,初步阐明了它们导致CD36缺失的分子基础及在广西人群中的分布特征,为中国人群CD36缺失的分子机制及特征研究提供了实验和理论依据。

小鼠淋巴瘤L5178Y细胞tk基因自发分子突变研究

背景与目的:研究小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因的自发突变频率和分子突变。材料与方法:进行4次平行试验,计算自发突变频率。选择tk基因自发突变子(tk-/-),提取基因组DNA,经等位基因特异性PCR扩增,杂合性缺失(Lossofheterozygosity,LOH)分析和测序等技术,分析其分子突变谱。结果:L5178Y细胞tk基因的平均自发突变频率为145×10-6,tk基因自发突变LOH平均发生率为79.8%。由LOH分析的试验结果显示,自发突变的LOH在大集落(Largeclone,LC)与小集落(Smallclone,SC)之间差异无统计学意义。序列分析证实,自发tk基因点突变主要为碱基置换。结论:tk基因的自发突变是以功能性等位基因缺失为主的分子突变,其中点突变以碱基置换为主。

食管癌中3p24和11p15.5染色体位点潜在抑癌基因的研究

目的 :探讨 3p2 4染色体位点的杂和缺失和 11p15 .5位点的点突变同食管癌之间的相关性 ,寻找这两个位点中潜在的抑癌基因 ,并希望通过此研究能为最后确定该基因的功能奠定基础。 方法 :用 PCR- RFL P法检测3p2 4染色体的三个位点 (EAβ MD、EAβ H、EAβ R)上等位基因的杂合缺失情况 ,PCR- SSCP法检测 11p15 .5位点的点突变。 结果 :经 RFL P法显示 :在 3p2 4的 EAβ MD位点 ,杂合缺失率为 75 % ,EAβ H位点的杂合缺失率为5 0 % ,EAβ R位点的杂合缺失率为 6 .2 5 % ;SSCP法未发现 11p15 .5位点存在点突变。 结论 :EAβ MD和 EAβ H位点的杂合缺失率较高 ,此两位点可能存在抑癌基因 。

普通小麦与山羊草叶绿体基因组长度热点突变区的核苷酸序列分析

检测了Ae.speltoides和Ae.ovata叶绿体基因组的一个长度热点突变区的核苷酸序列,并与普通小麦、四倍体Ae.crassa以及Ae.squarrosa的相应序列进行了比较分析。从rbcL基因的终止密码子到cemA基因内的HindIII位点,Ae.speltoides和Ae.ovata的核苷酸序列长度分别为2808和2810bp。与四倍体Ae.crassa的序列相比,在普通小麦和Ae.speltoides中各有一个791bp的大片段缺失,在Ae.ovata中存在一个793bp的大片段缺失。Ae.ovata的缺失片段比普通小麦和Ae.speltoides的长2个碱基,推测Ae.ovata的大片段缺失在进化上是独立发生的。Ae.speltoides的大片段缺失与普通小麦的完全相同,支持Ae.speltoides是普通小麦叶绿体基因组供体的假说。除了大片段缺失外,在这个区域还检测到了7个插入/缺失和15个碱基替换突变。研究结果表明,这个长度热点突变区的核苷酸序列分析是研究小麦与山羊草叶绿体基因组之间遗传变异关系的一个非常有效的途径。

NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响

探讨NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响。采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins,GFP)载体pEGFP-N3-NOD2wt,并构建NF-κB结合位点2个碱基缺失突变的载体,将构建的重组质粒瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果显示重组质粒转染HEK293细胞后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,其中pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在HEK293细胞中荧光表达较强,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱。说明NF-κB结合位点是驱动NOD2基因转录的重要元件,且在NOD2基因启动子的调控中发挥了正调节作用,为进一步研究NOD2基因表达及调控机制提供了新的思路。

应用分子遗传学方法分析和诊断人类遗传病

在西欧,1/30的儿童出生时就具有一种遗传缺陷——先天代谢错误(异常),即先天畸形或心身发育迟缓。(1) 大约0.7％的新生儿具有一种染色体异常。(2) 而大约1％的人是由单基因突变(0.5～1％为常染色体显性,0.2％为常染色体隐性和0.1％性连锁)所致的一种遗传病的携带者。 DNA重组技术推动了在原发病变(在染色体或线粒体DNA)水平上及转录水平上对遗传病的研究。

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因突变研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG、inhA、ahpC、kasA及oxyR基因突变特点。方法对144株结核分枝杆菌临床分离株(耐异烟肼菌株101株;异烟肼敏感株43株)的katG、inhA、kasA、ahpC及oxyR基因进行DNA片断扩增及DNA序列分析,与GeneBank中结核分枝杆菌标准序列进行比较。结果(1)耐异烟肼菌株中未发现katG完全缺失,81株耐药株(80.2%)katG存在点突变、缺失或插入,其中16个突变位点未见报道;39株(38.6%)耐药株第315位点突变,低耐药菌株(1μg/ml)第315位点突变率显著高于高耐药菌株(10μg/ml;χ2=9.31,P<0.05);58株(57.4%)耐药株第463位点突变。23株(53.3%)敏感株第463位点突变。(2)5株(4.9%)耐药株inhA发生突变。敏感株inhA无突变。(3)3株(2.9%)耐药株ahpC发生突变。敏感株ahpC无突变。(4)17株(16.8%)耐药株kasA发生突变。敏感株中3株菌株Gly312Ser突变。(5)在全部菌株中未发现oxyR基因突变。(6)综合本项研究中各基因的突变情况,共有91株耐异烟肼菌株发生与异烟肼耐药相关的突变。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG、inhA、ahpC及kasA基因突变之间的关系,并且提示还有其他机制参与异烟肼耐药。

P53结合位点在NOD8启动子基因克隆调节及其对NOD8基因中的作用

为探讨P53结合位点在NOD8基因调控中的作用,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有P53结合位点人NOD8基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-C2中,构建含有人P53结合位点的人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8;并构建P53结合位点缺失突变载体pEGFP-C2-NOD8,将构建的质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。用不同浓度的p53抑制剂PFT-α(pifithrinalpha,PFT-α)预处理HEK293细胞24 h后,将重组质粒pEGFP-C2-NOD8wt瞬时转染HEK293细胞,观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明pEGFP-C2-NOD8wt和mpEGFP-C2-NOD8经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功。细胞转染后,缺失P53结合位点的NOD8启动子驱动的绿色荧光蛋白荧光强度明显低于含P53结合位点的重组质粒;且不同浓度PFT-α预处理HEK293细胞后重组质粒绿色荧光蛋白表达下降呈剂量依赖性。结论是P53结合位点突变重组质粒在HEK293细胞中其绿色荧光表达明显减弱;PFT-α可以通过抑制P53表达使重组质粒pEGFP-C2-NOD8wt在细胞中绿色荧光表达呈剂量依赖性减弱。说明P53结合位点在NOD8基因调控中发挥了正调节作用。

NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用

目的探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用。方法以人基因组DNA为模板，PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列，以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构，将这段序列进行酶切并定向克隆人表达载体pEGFP-N3中，构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）载体，将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINE^TM 2000介导瞬时转染HeLa细胞，在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP。用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变，将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞，观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功，并且NF-κB结合位点突变成功。细胞转染结果表明，构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞，在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光，而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱，与未转染质粒相近。结论成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒；NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞中绿色荧光表达明显减弱，说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用；为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。

一个PARK2基因复合杂合突变导致的帕金森病家系的遗传学研究

目的明确1个兄弟3人患病的帕金森病家系的致病突变。方法收集所有患者及家系成员的外周血DNA及RNA,综合应用多重连接探针扩增及下一代测序技术检测帕金森病的致病突变。对所发现的剪接位点突变,用患者RNA逆转录而成的cDNA进行验证。结果多重连接探针扩增发现先证者存在PARK2基因第3外显子杂合缺失。下一代测序发现先证者存在PARK2基因第6外显子上游3个碱基处1处剪接位点突变(c.619-3G>C),并通过Sanger测序证实。cDNA样本测序证实c.619-3G>C造成第6外显子剪接异常,同时也证实两个突变在家系内均与疾病共分离。结论该家系为PARK2基因复合杂合突变致病。c.619-3G>C突变可导致第6外显子剪接异常,丰富了PARK2基因的致病突变谱。