多倍体肿瘤巨细胞对肿瘤耐药作用机制的研究进展

化疗是肿瘤治疗的常用手段,在肿瘤治疗前期具有积极作用,但随着化疗疗程的增加,肿瘤细胞对化疗药物的敏感性逐步减弱,从而产生化疗耐药性。肿瘤耐药是多因素介导的复杂过程,目前认为其与肿瘤细胞干性、异质性、肿瘤免疫微环境和化疗药物转运与外排增加等有关,但具体的机制尚不清楚。多倍体肿瘤巨细胞(polyploid giant cancer cell,PGCC)是一类体积增大、胞核丰富的特殊肿瘤细胞亚群。研究发现PGCC普遍存在于结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中,与肿瘤的发生、转移、耐药和复发有着密切联系。阐述PGCC在肿瘤中的形成及意义,并从PGCC所具有的特殊机制、自噬、衰老和DNA修复等角度阐述PGCC引起耐药发生的可能机制,从而为改善肿瘤耐药提供可能策略。

基于多倍体肿瘤巨细胞的抗肿瘤研究进展

肿瘤研究的不断深入揭示了肿瘤细胞的多样性和复杂性。研究表明,当肿瘤细胞受到放疗、化疗或缺氧等刺激后,可以形成多倍体肿瘤巨细胞(PGCC)以抵抗外界生存胁迫,PGCC在一段时期的休眠后,可重新恢复增殖。相较于正常二倍体肿瘤细胞,PGCC具有更强的成瘤能力、侵袭转移能力和耐药性,可以促进肿瘤的发生发展、侵袭转移,驱动肿瘤复发,是肿瘤获得异质性的重要来源,是一种十分恶性的肿瘤细胞亚群。近年来基于对PGCC在肿瘤发生发展及治疗中重要作用的认识,有研究者提出一些具有潜力的抗肿瘤治疗方案。本文就PGCC的生物学特征、形成机制,其对微环境的高耐受性、对肿瘤发展的影响,以及针对PGCC的治疗方案等方面的研究作一综述。

多倍体肿瘤巨细胞的研究进展

多倍体肿瘤巨细胞(polyploid gaint cancer cells,PGCCs)是一类拥有特殊细胞周期的细胞,存在于多种实体肿瘤中。过去常认为此类细胞处于衰老、凋亡边缘,不能分裂且无法生存,但近年发现PGCCs可在化疗、放疗、缺氧等条件下存活,并参与肿瘤的发展、治疗抵抗以及转移复发等。本文围绕PGCCs的研究现状进行阐述,为肿瘤的研究提供新思路。

多西他赛诱导的多倍体肿瘤细胞在肿瘤复发中的作用

目的研究多西他赛诱导的多倍体肿瘤细胞迁移、上皮间质转化特性及免疫细胞对其杀伤作用,以探讨多倍体肿瘤细胞在肿瘤复发中的潜在作用。方法使用1μmol/L多西他赛处理人非小细胞肺癌A549细胞24 h后收集的细胞为Doc 1 d组,撤除药物,细胞继续在新鲜的完全培养基中培养至第3天或第5天后收集的细胞分别为Doc 3 d组和Doc 5 d组,以DMSO处理A549细胞24 h作为对照组。采用免疫荧光染色法检测细胞形态,流式细胞术检测细胞倍性,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测细胞上皮间质转化相关蛋白的表达,乳酸脱氢酶释放法评估细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞的杀伤活性。结果与对照组相比,Doc 1 d组、Doc 3 d组、Doc 5 d组细胞多数发生凋亡,少数存活的细胞体积明显增大,且细胞核呈多核状态。对照组、Doc 1 d组、Doc 3 d组、Doc 5 d组多倍体细胞亚群(DNA含量>4N)比例分别为(1.93±0.55)%、(22.97±2.37)%、(51.30±12.51)%、(67.87±8.31)%,4组间差异具有统计学意义(F=26.521,P<0.001),Doc 1 d组、Doc 3 d组、Doc 5 d组多倍体细胞亚群比例均明显高于对照组,差异均具有统计学意义(均P<0.001),且随着撤药时间的延长,Doc 3 d组、Doc 5 d组多倍体细胞亚群比例明显高于Doc 1 d组,差异均具有统计学意义(P=0.009;P=0.004)。对照组细胞在培养24 h、48 h后,伤口愈合率均达100%;Doc 3 d组在培养24 h、48 h后,伤口愈合率分别为(39.10±2.12)%、(46.13±5.32)%,差异无统计学意义(t=2.126,P=0.051);与对照组24 h、48 h相比,Doc 3 d组细胞迁移能力明显降低,差异均具有统计学意义(t=49.756,P<0.001;t=30.825,P<0.001)。与对照组相比,Doc 1 d组、Doc 3 d组和Doc 5 d组细胞中E-cadherin蛋白表达逐渐下调,Vimentin蛋白表达逐渐上调,Snail蛋白、N-cadherin蛋白表达均未发生明显改变。CIK细胞对对照组、Doc 3 d组、Doc 5 d组细胞的杀伤效率分别为(27.27±1.91)%、(17.87±2.35)%、(9.47±0.51)%,3组间差异具有统计学意义(F=11.294,P<0.001),Doc 3 d组、Doc 5 d组细胞的杀伤效率明显低于对照组,差异均具有统计学意义(P=0.004;P<0.001),Doc 5 d组细胞的杀伤效率明显低于Doc 3 d组,差异具有统计学意义(P=0.003)。结论多西他赛诱导的多倍体肿瘤细胞迁移能力减弱,但易发生上皮间质转化,且免疫细胞对其杀伤作用降低。

SPTBN1对结直肠腺癌细胞及其多倍体肿瘤巨细胞生物学行为的影响及分子机制

目的探讨SPTBN1在结直肠腺癌细胞及其多倍体肿瘤巨细胞(polyploid giant cancer cells,PGCCs)中的作用及分子机制。方法应用CPTAC数据库分析结直肠腺癌组织和癌旁正常组织中SPTBN1蛋白表达水平;应用Kaplan-Meier Plotter、PrognoScan和UALCAN数据库分析SPTBN1蛋白表达与结直肠腺癌患者生存率的关系;应用Western blot法检测SPTBN1在结直肠腺癌组织和PGCCs中的表达量;应用平板克隆实验和划痕实验检测细胞的增殖与迁移能力;利用siRNA沉默PTPRN2和SPTBN1蛋白的表达。结果CPTAC数据库分析显示,SPTBN1蛋白在结直肠腺癌中的表达明显降低,其低表达与结直肠腺癌临床分期呈正相关;生存分析结果显示,SPTBN1低表达组患者的总生存率显著低于高表达组;应用奥沙利铂诱导的HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs,其增殖和迁移能力强于对照组HCT116和LOVO细胞;Western blot结果显示,SPTBN1蛋白在结直肠腺癌组织和PGCCs中的表达明显下降;SPTBN1敲低组HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞的增殖和迁移能力增强;GEPIA数据库结果显示,SPTBN1蛋白表达与PTPRN2、E-cadherin蛋白表达呈正相关;敲低SPTBN1后,HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞中E-cadherin蛋白表达水平下降;敲低PTPRN2后,HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞中SPTBN1、E-cadherin蛋白表达水平明显降低。结论SPTBN1在结直肠腺癌和PGCCs中低表达,敲低SPTBN1可促进HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞的增殖与迁移,其机制可能与PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路相关。

多烯紫杉醇诱导的卵巢癌SK-OV-3多倍体肿瘤巨细胞增殖、迁移和凋亡的特性研究

目的:探讨多烯紫杉醇(Docetaxel,Doc)诱导的卵巢癌SK-OV-3多倍体肿瘤巨细胞增殖、迁移和凋亡的特性。方法:0.8μmol/L Doc处理SK-OV-3细胞16 h,更换为完全培养液继续培养细胞至第3天和第5天。免疫荧光染色法观察细胞形态和增殖,流式细胞术检测细胞倍性、周期和凋亡,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测凋亡相关蛋白表达。结果:Doc处理后SK-OV-3细胞体积变大,细胞核增多,细胞增殖能力降低。Doc(3 day)组和Doc(5 day)组多倍体细胞(>4 N)百分比高于对照组(P<0.01)。Doc诱导Doc(16 h)组发生细胞周期阻滞。Doc(5 day)组细胞迁移能力低于对照组(P<0.01)。Doc(3 day)组和Doc(5 day)组早期凋亡细胞百分比高于对照组(P<0.05)。Doc(16 h)组、Doc(3 day)组和Doc(5 day)组促凋亡蛋白表达逐渐上调,抗凋亡蛋白表达下调。结论:Doc诱导卵巢癌SK-OV-3细胞形成多倍体肿瘤巨细胞,SK-OV-3多倍体肿瘤巨细胞增殖和迁移能力降低,早期凋亡增加,这为探索多倍体肿瘤巨细胞特性提供了研究基础。

多倍体肿瘤巨细胞研究进展

多倍体肿瘤巨细胞(PGCCs)是一种特殊类型的癌细胞亚群,常含有单个巨大的细胞核或多个细胞核,且细胞核通常不规则。与普通二倍体肿瘤细胞相比,PGCCs细胞周期、增殖方式、分化能力、形态、大小、染色体异常、致瘤性、抵抗放化疗等方面均不相同。过去常认为PGCCs处于有丝分裂的阻滞期并且处于细胞凋亡的边缘,是无法存活的,因此不被重视。但是最近研究发现,PGCCs不仅是可生存的,而且具备胚胎干细胞样特性,通过不对称分裂产生子代细胞,进行多向分化,且在肿瘤耐药、上皮间质转化和侵袭转移中发挥重要作用。本文就PGCCs近年来的研究进展进行综述,为临床治疗提供一种新的方向和思路。

顺铂诱导多倍体肿瘤巨细胞模型的构建

目的:探讨顺铂在体外诱导肿瘤细胞构建多倍体肿瘤巨细胞(PGCC)模型的方法,并对构建的细胞模型特性进行考察。方法:分别采用1.5、3、6、12、24μg/mL的顺铂处理A549细胞24 h,以及3μg/mL的顺铂处理3、4、5 d,流式细胞术检测其DNA含量变化,选择DNA含量最高的组合作为顺铂诱导A549、HepG2、SK-OV-3细胞形成PGCC的浓度和时间;Giemsa染色观察3种已处理细胞的表面积和DNA核面积变化;逆转录定量PCR检测3种已处理细胞的干性基因Nanog、Sox-2、OCT-4、c-Myc的mRNA表达情况,流式细胞术检测3种已处理细胞的干性表面标志物CD44、CD133的表达情况;β-半乳糖苷酶染色检测3种已处理细胞的衰老情况;MTT法检测0.75、1.5、3、6、12、24、48、96μg/mL顺铂作用于3种已处理细胞72 h的细胞活力。结果:3μg/mL顺铂处理3 d可有效诱导3种细胞系形成多倍体(>4N)细胞。诱导后的细胞表现出以下特征:细胞和核面积显著增大;干性标志物CD44、CD133表达不同程度上调,部分干性基因表达增加;部分A549细胞呈现衰老表型;与对照组相比,源于A549和SK-OV-3细胞的PGCC对顺铂的耐受性增强(P<0.01)。结论:成功建立了顺铂诱导的源于A549细胞的PGCC模型,该模型诱导的A549 PGCC具有增大的细胞表面积和核面积,表达干性基因Nanog、Sox-2、OCT-4,对顺铂的耐受度增加,为进一步研究肿瘤耐药机制提供了有效的实验平台。

3D培养的非小细胞肺癌多倍体巨细胞模型构建及其生物学特性的研究

目的探索三维(3D)人非小细胞肺癌多倍体巨细胞与二维(2D)模型的基因表达差异。方法人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299购自中国科学院上海细胞库。培养非小细胞肺癌NCl-H1299细胞球体,加入多西紫杉醇(Doc)2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L诱导,24 h后取出药物继续在新鲜培养基中培养72 h,收集细胞,另设未加药组作为对照组。Hochest染色观察细胞核的变化,活-死细胞染色试剂盒观察细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞倍性,RT-PCR检测上皮间充质转化相关基因以及干性相关基因的表达差异。结果3D培养的NCl-H1299细胞经Doc处理后细胞核增大,Calcein AM/PI染色显示Doc处理组细胞的死亡情况与加药浓度成正相关。5μmol/L组细胞多倍体细胞比例(35.2±5.88)明显高于对照组(17.26±2.26),3D培养的Doc处理组的早期凋亡[(9.06±1.24)%]低于对照组[(16.2±1.82)%],晚期凋亡[(19.73±1.98)%]低于对照组[(26.13±1.36)%],2D培养的Doc处理组早期凋亡[(23.96±1.82)%]高于对照组[(0.94±0.41)%],晚期凋亡[(23.91±0.96)%]高于对照组[(2.66±0.84)%],差异均有统计学意义(P<0.05)。3D多倍体肿瘤巨细胞模型上皮间质转化相关基因相较2D模型表达降低,3D培养细胞干性相关基因经Doc处理后与在2D培养中趋势相反。结论本研究成功构建了非小细胞肺癌多倍体巨细胞3D培养模型,并证明其在上皮间充质转化与干性相关基因表达与2D培养模型上有一定的差异,该模型可更好地模拟体内肿瘤的发展变化。

多倍体肿瘤巨细胞与肝内胆管细胞癌临床病理学特征及预后研究

目的 探讨多倍体肿瘤巨细胞(PGCC)阳性肝内胆管细胞癌(ICC)病人的临床病理特征及其对预后的影响。方法 回顾性分析2005年6月至2019年6月在天津医科大学肿瘤医院接受手术的72例ICC病人的临床病理学资料,应用HE染色组织病理学分析ICC中PGCC的分布和比例,通过多变量回归分析探索PGCC与ICC临床病理学特征及术后总生存期(OS)和无复发生存期(DFS)的关系。结果 在72例ICC中,血管侵犯和术前总胆红素水平是影响ICC预后OS的独立危险因素;PGCC是影响ICC预后DFS的独立危险因素,手术切除样本中PGCC阳性ICC病人的DFS劣于PGCC阴性的病人(P<0.01)。进一步的Logistic多因素分析表明PGCC与ICC的病理学分期和肿瘤的分化程度密切相关。Ⅱ~Ⅲ期病人较Ⅰ期病人具有更高的PGCC比例(P=0.006);同时低分化的ICC较中-高分化的ICC具有更高的PGCC比例(P=0.032)。结论 PGCC与ICC病人预后不良密切相关,是影响胆管癌病人DFS的独立危险因素,有望成为评估胆管癌预后生存及指导临床诊疗的新指标。

罗米地辛对肺癌多倍体肿瘤巨细胞生物学行为的影响

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂罗米地辛对肺癌多倍体肿瘤巨细胞(PGCC)生物学行为的影响。方法人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299购自中国科学院上海细胞库。用100 nmol/L多西他赛处理NCI-H1299细胞24 h,建立肺癌PGCC模型,作为PGCC组;用100 nmol/L罗米地辛处理PGCC组细胞48 h,记为PGCC+罗米地辛组;将二甲基亚砜(DMSO)处理组细胞记为DMSO组。采用流式细胞术检测细胞DNA含量;细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞迁移能力;流式细胞术检测线粒体膜电位;Western blot检测细胞中存活素蛋白(Survivin)、骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物蛋白(c-Myc)、波形蛋白(Vimentin)、B细胞淋巴瘤/白血病-x基因长片段蛋白(Bcl-xl)和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。结果流式细胞术检测细胞DNA含量结果显示,PGCC组PGCC亚群(DNA含量>4 N)百分比[(60.53±9.92)%]明显高于DMSO组[(2.08±0.62)%],差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8检测结果表明,随着罗米地辛药物浓度逐渐增加,其对细胞抑制率也逐渐增高,同时,罗米地辛处理肺癌PGCC 48 h对细胞抑制率高于24 h,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell检测结果显示,PGCC+罗米地辛组细胞迁移数[(13±1)个]明显少于PGCC组[(51±2)个];FACScantoⅡ流式细胞仪检测样本结果显示,PGCC+罗米地辛组的红色荧光/绿色荧光比值(2.31±0.10)明显低于PGCC组(4.55±0.52);Westernblot检测结果显示,与PGCC组相比,PGCC+罗米地辛组中Survivin、c-Myc、Vimentin和Bcl-xl表达水平明显下调,Bax表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论罗米地辛能够抑制肺癌PGCC增殖和迁移能力,并促进肺癌PGCC凋亡。

乙醛脱氢酶1酶活性对多西他赛诱导的多倍体肿瘤巨细胞血管生成和迁移影响

目的探究乙醛脱氢酶1(ALDH1)酶活性变化对肺癌多倍体肿瘤巨细胞(PGCC)血管生成和迁移的影响。方法常规培养的非小细胞肺癌细胞(A549、H1299细胞)为常规组,10 mmol/L的4-(N,N二乙基)氨基苯甲醛(DEAB)处理细胞12 h,撤除药物后在完全培养基中继续培养细胞至第3天为DEAB组;1 mmol/L多西他赛处理细胞24 h,撤除药物后在完全培养基中培养至第3天为多西他赛组;10 mmol/L的DEAB预处理细胞12 h后,1 mmol/L多西他赛处理24 h,撤除药物后在完全培养基中培养至第3天为多西他赛+DEAB组。流式细胞术检测细胞DNA含量;乙醛脱氢酶(ALDH)测定试剂盒测定ALDH1活性;细胞划痕实验检测迁移能力;血管生成拟态(VM)实验和小管形成实验检测血管生成能力;蛋白印迹法(WB)检测细胞中N-cadherin、Vimentin、血管内皮生长因子(VEGF)A抗体和VE-cadherin蛋白表达水平。结果多西他赛组A549细胞、H1299细胞PGCC亚群比例高于常规组;多西他赛组A549细胞、H1299细胞ALDH1酶活性高于常规组;多西他赛+DEAB组A549细胞、H1299细胞ALDH1酶活性低于多西他赛组;差异均有统计学意义(P<0.05)。多西他赛+DEAB组A549细胞、H1299细胞的细胞迁移率低于多西他赛组,差异有统计学意义(P<0.05)。多西他赛+DEAB组A549细胞分支点数量和小管总长度降低,差异有统计学意义(P<0.05)。多西他赛组A549细胞、H1299细胞N-cadherin、Vimentin的表达高于常规组;多西他赛+DEAB组A549细胞、H1299细胞N-cadherin、Vimentin的表达低于多西他赛组,差异有统计学意义(P<0.05)。HUVEC(多西他赛+DEAB组A549细胞条件培养基处理)形成的小管分支点数量和总长度均低于HUVEC(多西他赛组A549细胞条件培养基处理);HUVEC(多西他赛+DEAB组H1299细胞条件培养基处理)形成的小管分支点数量和总长度均低于HUVEC(多西他赛组H1299细胞条件培养基处理),差异有统计学意义(P<0.05)。多西他赛组A549细胞VE-cadherin、VEGFA抗体表达水平高于常规组,多西他赛+DEAB组A549细胞VE-cadherin、VEGFA抗体的表达水平低于多西他赛组;多西他赛组H1299细胞VEGFA抗体表达水平高于常规组,多西他赛+DEAB组H1299细胞VEGFA抗体表达水平低于多西他赛组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论多西他赛能诱导A549、H1299细胞产生PGCC,并伴随ALDH1酶活性增高,ALDH1酶活性升高参与PGCC迁移和血管生成,但对PGCC的产生无影响。

调控自噬对放射诱导多倍体宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的研究调控自噬对放射诱导多倍体宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法人宫颈癌细胞系Hela购自中国科学院上海细胞库。将未经照射的宫颈癌细胞系Hela作为对照组,经7 Gy剂量X线照射的Hela细胞、氯喹(50μmol/L)预处理1 h后经7 Gy剂量X线照射的Hela细胞分别记为7 Gy组和7 Gy+氯喹组。流式细胞术检测细胞倍性,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖率,划痕实验和Transwell侵袭试验分别检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测细胞自噬、周期相关蛋白和上皮间质转化相关标志物的表达水平。结果倍性分析结果显示,对照组、7 Gy组、7 Gy+氯喹组的多倍体细胞亚群(DNA含量>4 N)比例[(5.30±0.46)%、(32.27±2.48)%、(26.37±0.90)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,培养24 h后,对照组、7 Gy组、7 Gy+氯喹组的细胞增殖率[(97.50±2.43)%、(73.27±5.86)%、(55.70±13.05)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05);培养48 h后,对照组、7 Gy组、7 Gy+氯喹组的细胞增殖率[(158.84±1.62)%、(113.64±7.02)%、(75.42±4.33)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示,划痕24 h后,对照组、7 Gy组、7 Gy+氯喹组的划痕愈合面积百分率[(68.68±1.73)%、(51.79±2.53)%、(40.40±8.81)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05);划痕48 h后,对照组、7 Gy组、7 Gy+氯喹组的划痕愈合面积百分率[100%、(77.11±5.96)%、(46.611±0.82)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示,对照组、7 Gy组、7 Gy+氯喹组的侵袭细胞数[(184.33±20.03)个、(73.00±11.14)个、(24.33±3.51)个]比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,对照组、7 Gy组、7 Gy+氯喹组的自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ/自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅰ、P-cdc25c(ser216)、cdc25c(5H9)、E钙黏蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论调控自噬能够抑制多倍体肿瘤细胞的产生,降低放射诱导宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示自噬可能在宫颈癌细胞的放射抵抗中起着重要的作用。

自噬通过诱导休眠多倍体巨大肿瘤细胞形成促进鼻咽癌复发的研究

目的探究休眠的多倍体巨大肿瘤细胞(polyploid giant cancer cells,PGCC)对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)复发的影响,明确抑制自噬在阻止NPC复发中的作用。方法利用紫杉醇(paclitaxel,PTX)诱导NPC细胞来源的PGCC(NPC-PGCC)形成,并利用光学显微镜、细胞免疫荧光、活/死细胞双染色实验对PGCC形态、多倍体特性、细胞活性等进行鉴定。采用转录组测序(RNA-seq)检测NPC-PGCC和二倍体NPC细胞CNE2的差异表达基因。采用基因本体论(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对差异基因进行功能富集和通路注释分析。利用免疫蛋白印迹与细胞透射电镜实验评估NPC-PGCC细胞中的自噬水平。利用临床高度相关的裸鼠NPC复发模型研究自噬在NPC-PGCC形成中的作用及NPC-PGCC对NPC复发的影响。所有数据采用GraphPad Prism 6进行统计学分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果紫杉醇诱导形成的NPC-PGCC具有休眠后爆炸性分裂的特征。NPC-PGCC和二倍体NPC细胞CNE2的差异基因GO富集、KEGG通路注释主要集中在自噬及其相关通路。NPC-PGCC细胞中的自噬水平显著增强。临床高度相关裸鼠NPC复发模型中,进行顺铂治疗的裸鼠原发肿瘤中PGCC数量高于其余各组;自噬抑制剂预处理后与顺铂联合治疗的裸鼠原发肿瘤中PGCC数量少,同时复发率显著低于其余各组。结论休眠多倍体巨大肿瘤细胞的形成机制与自噬有关,抑制自噬可通过抑制PGCC形成进而抑制NPC复发。

VEGF-CDC42-P38MAPK参与调控多倍体肿瘤巨细胞(PGCCs)及其子代细胞的迁移侵袭

通过提取总蛋白和细胞质和核蛋白,比较LoVo和HCT116对照细胞和450μmol/L CoCl;处理后细胞中VEGF、CDC42和p38 MAPK的表达水平,实验结果显示,与对照组相比,处理组细胞中VEGF、CDC42和p38 MAPK的总蛋白水平升高.通过免疫细胞化学检测CoCl;处理前后细胞中VEGF、CDC42、p38 MAPK的表达及定位,结果显示VEGF、CDC42位于细胞质中的表达,p38 MAPK位于细胞质和细胞核中的表达.通过瞬时转染小干扰RNA来敲低CDC42的表达,检测VEGF和p38 MAPK的蛋白表达并通过平板克隆形成试验、Transwell迁移和侵袭试验比较处理组细胞在敲低CDC42前后的增殖、迁移和侵袭能力.实验结果表明CDC42敲低后,CoCl;处理后细胞的迁移和侵袭能力下降.本实验证明PGCCs及其子代细胞的高侵袭和迁移能力与VEGF-CDC42-p38 MAPK信号通路有关.

辐射诱导的多倍体宫颈癌HeLa细胞生物学特性研究

目的研究辐射诱导的多倍体宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的生物学特性,以探讨多倍体HeLa细胞利于宫颈癌放疗后复发的潜在作用。方法使用6 MV-X射线分别以7 Gy、14 Gy的剂量照射HeLa细胞,继续孵育3 d后收集细胞并标记为7 Gy组和14 Gy组,将未经辐射的细胞作为对照组。光镜下观察细胞形态,流式细胞术检测细胞DNA倍性,MTT法检测细胞增殖,AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移及侵袭的能力,蛋白质印迹法检测细胞STAT3信号通路相关蛋白表达。结果与对照组相比,7 Gy组和14 Gy组HeLa细胞体积明显增大。对照组、7 Gy组、14 Gy组多倍体HeLa细胞亚群比例分别为(6.33±1.26)%、(21.13±0.50)%、(46.07±1.68)%,3组间差异具有统计学意义(F=780.47,P<0.001)。对照组、7 Gy组和14 Gy组多倍体HeLa细胞培养24 h后吸光度值分别为0.21±0.01、0.23±0.02、0.16±0.01;48 h后分别为0.37±0.03、0.38±0.06、0.21±0.00;72 h后分别为0.66±0.02、0.55±0.01、0.28±0.01,3组间增殖情况差异有统计学意义(F=31.62,P=0.001;F=20.10,P=0.002;F=708.52,P<0.001)。进一步两两比较,培养24、48、72 h后14 Gy组多倍体HeLa细胞增殖活力均较对照组细胞和7 Gy组多倍体HeLa细胞显著下降(均P<0.05)。对照组、7 Gy组和14 Gy组多倍体HeLa细胞的凋亡亚群比例分别为(3.67±1.16)%、(3.07±0.81)%、(3.83±0.91)%,其中早期凋亡细胞亚群比例分别为(2.33±0.35)%、(2.13±0.61)%、(2.23±0.32)%,晚期凋亡细胞亚群比例分别为(1.33±0.81)%、(0.93±0.31)%、(1.60±0.60)%,差异均无统计学意义(F=0.52,P=0.620;F=0.15,P=0.864;F=0.92,P=0.450)。对照组、7 Gy组和14 Gy组的多倍体HeLa细胞迁移数目分别为297.40±26.53、121.33±15.16、18.40±4.79,侵袭细胞数目分别为195.67±20.26、63.60±6.91、9.47±3.23,差异具有统计学意义(F=647.28,P<0.001;F=213.94,P<0.001)。7 Gy和14 Gy组多倍体HeLa细胞的迁移与侵袭能力与对照组相比显著下降,14 Gy组多倍体HeLa细胞的迁移与侵袭能力显著低于7 Gy组(均P<0.001)。辐射诱导的多倍体HeLa细胞P-STAT3(Tyr 705)、Bcl-2的表达水平均高于对照组,且随着辐射剂量的增加表达水平进一步增高;与对照组相比,14 Gy组多倍体HeLa细胞Survivin、Mcl-1表达水平均上调(均P<0.05)。3组间Bcl-xL表达差异无统计学意义(F=0.52,P=0.618)。结论辐射诱导的多倍体HeLa细胞增殖、迁移及侵袭能力降低,凋亡率无显著变化,但STAT3信号通路激活伴随下游抗凋亡相关蛋白表达上调,有利于多倍体肿瘤细胞成为宫颈癌放疗后复发的潜在危险因素。

间充质干细胞条件培养基对多西紫杉醇诱导多倍体肺癌细胞衰老表型的研究

目的探讨间充质干细胞条件培养基对多西紫杉醇(Doc)诱导的多倍体肺癌细胞衰老表型的影响。方法人非小细胞肺癌1 299细胞株细胞分为3组, 常规组、Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组。常规组为二甲基亚砜处理细胞24 h;Doc(24 h)组为100 nmol/L的Doc处理细胞24 h;Doc(24 h)+3 d组为100 nmol/L的Doc处理细胞24 h, 更换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基, 继续培养3 d。Doc(24 h)+3 d组细胞分为2组, Doc组和Doc+CM组。Doc组为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养4 d;Doc+CM组为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和hUC-MSC-CM(1∶1)的混合培养基中培养4 d。Hoechst 33342染色观察细胞核形态, 流式细胞术分析细胞DNA含量、线粒体膜电位及DNA损伤应答信号分子磷酸化组蛋白H2A.X(γ-H2A.X)的表达, 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性, 实时定量聚合酶链式反应(RTQ-PCR)检测衰老相关的炎性细胞因子白细胞介素6(IL-6)与白细胞介素8(IL-8)的信使核糖核酸(mRNA)表达水平。结果 Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组细胞核体积增大、DNA含量增加, 常规组、Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组多倍体细胞百分比分别为(12.27±3.29)%、(27.13±6.02)%和(43.60±4.26)%, Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组细胞百分比明显高于常规组, 差异有统计学意义(F=33.91, P=0.001)。常规组、Doc(24 h)组与Doc(24 h)+3 d组细胞密度分别为(8.18±0.54)×10^(4)/cm^(2)、(3.78±0.54)×10^(4)/cm^(2)及(0.75±0.08)×10^(4)/cm^(2), Doc(24 h)组与Doc(24 h)+3 d组细胞密度显著低于常规组, 差异有统计学意义(F=212.55, P=0.001)。常规组细胞β-半乳糖苷酶无活性, 细胞染色阴性, Doc(24 h)组与Doc(24 h)+3 d组中观察到有呈蓝色的阳性染色细胞, β-半乳糖苷酶活性增强。流式细胞术分析线粒体膜电位, 常规组、Doc组与Doc+CM组的JC-1单体百分比分别为(1.7±1.2)%、(48.2±12.9)%及(46.6±12.0)%, Doc组与Doc+CM组低电势细胞百分比明显高于常规组, 差异有统计学意义(F=20.15, P=0.002), Doc组细胞与Doc+CM组细胞线粒体膜电位比较, 差异无统计学意义(F=20.15, P=0.854)。常规组、Doc组与Doc+CM组中γ-H2A.X表达阳性的细胞百分比分别为(54.9±3.2)%、(58.9±4.0)%及(60.6±5.4)%, 差异无统计学意义(F=1.40, P=0.317)。Doc组与Doc+CM组γ-H2A.X荧光信号强度明显高于常规组, 荧光信号右移, Doc组与Doc+CM组γ-H2A.X荧光信号强度没有差异, 荧光信号没有偏移。Doc组IL-6与IL-8的mRNA表达水平是常规组的(7.22±0.34)倍及(157.64±7.49)倍, 差异有统计学意义(t=1.00, P=0.001)。Doc+CM组IL-6与IL-8的mRNA表达水平是Doc组的(48±6)%及(43±3)%, 差异有统计学意义(t=1.00, P=0.001)。结论 Doc诱导人非小细胞肺癌1 299细胞株细胞产生多倍体肿瘤细胞, 即多倍体肺癌细胞, 多倍体肺癌细胞表现多种衰老表型特征, hUC-MSC-CM不改变Doc诱导的多倍体肺癌细胞衰老表型, 但显著降低了炎性因子IL-6和IL-8的mRNA表达水平。