人乳头瘤病毒6b型E7基因的克隆和表达

目的 克隆人乳头瘤病毒 6b型E7(humanpapillomavirus 6bE7)基因 ,构建原核表达载体 ,并进行蛋白表达和纯化。方法 将HPV 6bE7基因经PCR扩增和亚克隆 ,与GST原核表达载体pGEX 4T 2重组 ,转化E .coliP2 3 92 菌表达蛋白 ,经GlutathioneSepharose 4B亲和层析纯化GST HPV 6bE7融合蛋白。结果 限制性酶切和DNA测序表明 ,HPV 6bE7DNA正确克隆于 pGEX 4T 2多克隆位点。经IPTG诱导表达的GST HPV 6bE7融合蛋白主要存在于可溶性上清。经亲和层析 ,每升诱导菌回收 8.4mg融合蛋白 ,10 %SDS PAGE分析融合蛋白表观分子量约 3 7kDa。结论 成功构建了HPV 6bE7基因原核表达载体 ,并大量表达和纯化了GST HPV

人乳头瘤病毒11型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析

目的 从临床尖锐湿疣标本克隆人乳头瘤病毒(HPV ) 11型主要衣壳蛋白 L 1基因 ,进行序列测定及序列分析比较 ,以为研究该临床病毒株的免疫原性及流行病学奠定基础 .方法 以临床尖锐湿疣标本总 DNA为模板 ,用 L 1基因保守区简并引物以 PCR方法分段扩增衣壳蛋白 L1基因大部 ,重组入 p GEM- 3zf(- )质粒载体 ,以双脱氧法双向测定插入片段序列 ,拼接出 L1基因序列 ,通过 BL AST2 .0与已报道序列进行比较 .结果 从西安地区一尖锐湿疣临床标本克隆到的一株 HPV11型 L1蛋白编码序列与一文献报道大部分相同 ,但有些位点有点突变 .结论 构建的 p GEM- 3zf(- )重组质粒为进一步通过杂交。

人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆和序列分析

目的 从已感染人乳头瘤病毒 (HPV)的新鲜宫颈癌组织中获得 HPV16型晚期表达基因 L1,为 HPV感染的检测和治疗奠定基础 .方法 根据引物设计原则设计一对特异引物 ,并用 PCR方法从宫颈癌组织中获得 L1基因 ,用 p GEM- T作为克隆载体 ,构建重组质粒并以双脱氧法双向测定插入片段序列 ,拼接出 L1基因序列 ,自动测序验证并分析序列 .结果 从西安地区 1例宫颈癌临床标本克隆到的 1株 HPV16型 L1蛋白编码序列经 BL AST2 .0分析与既往报道序列存在高度同源性 .结论 构建的重组质粒为进一步研究 L

鲍温氏病组织人乳头瘤病毒16型结构基因L1的克隆及其序列分析

本研究采用 ＰＣＲ法从中国妇女鲍温氏病（Ｂｏｗｅｎ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）组织标本扩增获得了与宫颈癌密切相关的人乳头 瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）的晚期基因Ｌ１，并装入测序载体测序分析了其ＤＮＡ的序列，与标准型进行了比较，发现有 若干变异。此研究对序列及变异意义进行了分析和讨论，为今后Ｌ１基因分子流行病学调查、Ｌ１蛋白的结构与功能研 究、疫苗研制以及ＨＰＶ相关的基础性研究提供了有用的资料。同时在国内外首次报道了鲍温氏病组织中ＨＰＶ１６Ｌ１的 序列及其变异情况，并在ＧｅｎＢａｎｋ［１］申请到序列号（ＡＦ０８９５２）。

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的 为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法 利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果 从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论 该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。

人乳头瘤病毒16型E7基因的克隆和表达

用分子克隆技术在大肠杆菌中表达HPV16 E7基因。用限制性内切酶DdeⅡ将含有大部分E7基因的191bp片段从HPV16基因组中切出。将此片段与含有色氨酸操纵子的启动子的表达载体pATH10连接成重组DNA,用以转化E.coliDH5a,并筛选出阳性重组子。还进行了限制酶酶切分析和蛋白质SDS-PAGE分析。表达的新蛋白质带的分子量与预期的分子量相符。我们认为表达的新蛋白质是TrpE和E7蛋白的融合蛋白。

我国人乳头瘤病毒(HPV16Z)基因克隆和鉴定

本文作者采用基因克隆手段,以pAt153为载体,从一份山西襄垣宫颈癌高发区宫颈癌患者的手术标本中,成功地克隆到2株与HPV16同源的基因片段。经PstI、KpnI、TaqvI、PvuII等16种限制性内切酶酶谱分析及其部分基因序列的鉴定,证明这是在国内首次克隆到一侏分子量约为8.0kb完整的HPV16型全序列DNA及一株分子量为5.4kb的HPV16基因片段。经实验证明:该基因片段的E6、E7及部分LI基因丢失,在750单核苷酸处发生变异,产生一新的BamHI酶切位点。该完整的HPV16基因组被命名为HPV16Z,HPV16基因片段被命名为HPV16F。用新分离到的HPV16Z作分子探针,检测襄垣337份宫颈癌及阴道活检标本的HPV16型同源序列的结果显示,慢性阴道炎阳性率为17.28％(14/81);宫颈炎为11.89％(17/143);宫颈癌前病变为46.81%(22/47);宫颈癌为72.73%(48/66)。证明山西宫颈癌高发区宫颈癌前病变及宫颈癌组织中主要为HPV16Z感染。

人乳头瘤病毒16型E5转化基因的克隆及原核表达

目的建立人乳头瘤病毒16型E5基因的无性繁殖系为进一步研究其致癌机理作准备。方法用PCR技术从HPV16质粒DNA中扩增出E5基因序列连接到pGEM-T载体,将阳性的重组pGEM-T用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切并回收目的片段连接到原核表达载体pGEX-2T,转化DH5α菌株。取工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果①经PCR、测序和双酶切鉴定认为HPV16E5正确插入上述表达载体,建立了该转化基因的无性繁殖系。②经IPTG诱导的pGEX-2T-E5质粒表达出约42KD的融合蛋白,分析含有约16KDHPV16E5蛋白,与预期含HPV16E5的融合蛋白分子量相符。结论①采用PCR克隆技术,扩增HPV16E5转化基因目的片段,将其克隆到pGEM-T载体在国内首次建立了HPV16E5转化基因的无性繁殖子。②成功构建HPV16E5基因的原核表达质粒,并表达出GST-E5融合表达蛋白。

人乳头瘤病毒6b型L1基因的克隆及表达

目的研究尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒(HPV)6b型晚期基因L1(HPV6bL1)在真核细胞内的表达。方法 PCR技术扩增原核重组质粒PQE40-HPV6bL1中L1基因,酶切后与真核表达质粒PEGFP-C1连接,转化入感受态大肠埃希菌DH5α,经扩增后酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序。以重组质粒PEGFP-HPV6bL1转染COS-7细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达,RT-PCR检测HPV6bL1 mRNA的表达。结果双酶切及测序鉴定显示,重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,PEGFP-HPV6bL1构建成功。重组体成功转染进COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR检测到HPV6bL1 mRNA的表达。结论建立了HPV6bL1绿色荧光真核表达系统,为研究该蛋白质的功能奠定了基础。

应用PCR技术克隆人乳头瘤病毒16型E6基因

为进一步研究与宫颈癌发生密切相关的人乳头瘤病毒16型E6基因的转化作用,我们运用PCR技术扩增HPV16 E6 DNA,以pUC—19为载体,大肠杆菌了JM103为宿主菌,组建了质粒pRCE6经限制性核酸内切酶和Southern转印杂交证实,其插入片段约为0.5Kb,含有全部HPV16 E6序列。该质粒的组建为检测HPV感染中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针。同时为进一步研究HPV16 E6基因的转化作用及转化蛋白打下基础。

人乳头瘤病毒16型早期基因E6、E7的克隆及表达

高危人乳头瘤病毒16型的感染与宫颈癌的发病密切相关。HPV16E6和E7蛋白在大多数HPV16相关宫颈癌及其癌前病变中持续表达,因此E6和E7蛋白可作为制备HPV16相关肿瘤及其癌前病变治疗性疫苗的靶抗原〔2〕。采用套式PCR方法,从宫颈癌患者组织中扩增出E6、E7基因并成功构建了包含E6、E7的表达质粒PET-E6、PET-E7。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting分析结果表明,外源基因E6,E7在T7启动子控制下可获得稳定表达。

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白质基因L_1的克隆及表达

人乳头瘤病毒16型(HPV16)含有两个晚期开放读码框(L_1ORF和L_2ORF),L_1ORF编码主要衣壳蛋白,我们用质粒pHPV16、p16L_2BX_5和pATH,采用基因重组技术,制备了含有HPV16个长L_1ORF序列的基因克隆p16L_1BN(5071—253),它能在大肠杆菌中有效表达,产生分子量约90KD的含有E. coli trpE的融合蛋白。Western blot检测,该蛋白可被抗牛乳头瘤病毒的抗体识别,这说明克隆p16L_1BN能有效表达,基因产物具有乳头瘤病毒型的共同抗原的性质。

人乳头瘤病毒16型湖北株E_7基因的克隆和高效表达

利用基因克隆技术，将ＨＰＶ１６湖北株完整的Ｅ７基因克隆到含乳糖操纵子的表达载体ｐＷＲ５９０１上，经限制性酶切分析获得重组质粒ｐＷＨＢＥ７。ｐＷＨＢＥ７转化大肠杆菌后表达产生分子量为７０ｋＤ的融合蛋白ｌａｃＥ７，该蛋白在免疫印迹实验中可被标准Ｅ７单抗识别。经ＩＰＴＧ诱导后，Ｅ７融合蛋白产量可达细菌总蛋白含量的３０％以上。利用ｌａｃＥ７蛋白在细菌胞浆中形成包含体的性质，简便地提取并纯化了该蛋白质。结果为从免疫学角度探讨ＨＰＶ１６与宫颈癌的关系以及ＨＰＶ疫苗的研制打下基础。

人乳头瘤病毒16型完整E6开放读码框的基因克隆和鉴定

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）基因组中扩增得到５５５ｂｐ的Ｅ６ＤＮＡ片段，并重组到载体ｐＧＥＭＥＸＴＭ－１中，构建克隆扩增质粒ｐ１６Ｅ６－Ｇ，将此重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经菌落原位杂交鉴定和限制性酶切图谱分析，证实该产物为Ｅ６基因完整开放读码框（ＯＲＦ），从而为获得Ｅ６ＯＲＦ基因片段提供了一个高效。

人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列测定及编码氨基酸序列分析,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因,与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7,酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果:克隆出HPV11早期蛋白E6、E7基因,成功构建重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7。本研究克隆出的HPV11E7基因与GenBank标准株序列完全相同,E6基因有两个位点的变化。结论:本研究克隆出的HPV11E6、E7基因与标准株基本相同,这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。

人乳头瘤病毒16型早期基因E7的克隆及其在原核细胞中的表达

目的进一步研究与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的生物学活性。方法采用PCR法从中国妇女宫颈癌标本中扩增HPV16早期基因E7,测序分析其DNA的序列。结果克隆的HPV16E7基因与标准型进行比较表明,前者无核苷酸突变。将此基因装入原核表达载体,能在E.Coli中高效表达出谷胱甘肽S-转移酶(GST)-E7蛋白。Western印迹分析表明,此融合蛋白能与E7抗体特异地结合。结论克隆的HPV16E7基因及其表达的蛋白可为今后分子流行病学调查及疫苗研制提供有用的资料。

人乳头瘤病毒16型L1蛋白表达及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的表达并纯化重组人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白，建立分泌抗HPV16 L1单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。方法以基因工程表达HPV16L1蛋白。用Ni—NTA技术进行纯化后免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，经含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶（HAT）的选择培养基及有限稀释法进行克隆化，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，对获得的杂交瘤细胞株染色体进行计数．同时测定细胞培养上清mAb的效价。结果筛选出2株可分泌抗HPV16 L1 mAb的杂交瘤细胞，命名为AE3和AG7，染色体数分别为130条和98条。2株杂交瘤细胞AE3和AG7培养上清的效价分别为1：5120和1：80。结论成功建立了2株可分泌抗HPV 16 L1 mAb的杂交瘤细胞，为进一步研制HPV感染检测试剂盒提供实验基础。

鲍温样丘疹病组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析

目的 :克隆生殖器鲍温样丘疹病 (Bowenoidpapulosisofthegenetalia)组织中人乳头瘤病毒 16型L1基因并进行序列分析 .方法 :采用PCR法从 10例生殖器鲍温样丘疹病标本中扩增获得人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )的晚期基因L1,克隆入载体 ,并测序 ,分析其序列 .结果 :与HPV16L1标准型比较 ,发现 10例L1标本的序列存在若干变异 ,并由此引起所编码的氨基酸亦发生变化 .结论 :鲍温样丘疹病组织中HPV16L1基因序列存在一定程度的变异 ,其变异的临床意义有待于进一步探讨 .

人乳头瘤病毒16型转化基因的筛选及次级克隆

人乳头瘤病毒16型转化作用在宫颈癌发生中可能起重要作用,其转化基因主要位于基因组早期区域E6、E7开放阅读框架内。为了进一步研究HPV16转化作用,我们以Pstl+ECoRI酶解HPV16DNA,以pUC-19为载体,大肠杆菌JM103细胞为宿主菌,经两次定向次级克隆,组建了质粒pEP-8。经限制性核酸內切酶和Southem转印杂交证实,其插入片段为-1.43Kb带有E6、E7 ORF的DNA片段。在E6区上游序列还含有两个TATA盒,1个Cat盒和1个细胞特异性增强子。该质粒的组建为检测HPV感染细胞中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针,同时为进一步研究HPV转化作用及转化蛋白打下了基础。

人乳头瘤病毒6和11亚型E6、E7基因的克隆及序列分析

[目的]了解四川地区引起尖锐湿疣的HPV-6和11亚型早期基因E6、E7的结构和变异特点。[方法]采用PCR和T-A克隆技术从尖锐湿疣样本中扩增、克隆HPV-6/11E6、E7基因,最后对其测序并与原型进行序列比对。[结果]成功扩增和克隆了HPV-6/11E6、E7基因,其序列与原型序列相比,存在多处核苷酸的突变,并且有几处核苷酸的突变引发了氨基酸序列的突变,其中有3处引起氨基酸的突变为所有样本共有:HPV-6E6:252G→C(谷氨酰胺→组氨酸);HPV-6E7:685A→T(酪氨酸→苯丙氨酸);HPV11E7:662G→T(丙氨酸→丝氨酸)。[结论]四川地区HPV-6和11亚型E6、E7基因均存在一定程度上的变异,大部分的突变为同义突变,E6基因较E7基因更易突变。