抗极低密度脂蛋白受体多克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗极低密度脂蛋白受体的多克隆抗体 ,以极低密度脂蛋白受体配体结合域上特定片段的合成肽免疫新西兰家兔 ,收集免疫前后动物的血清 ,通过酶联免疫吸附法及免疫印迹法对血清中抗体进行分析和鉴定。结果发现 ,已获得高效价的抗极低密度脂蛋白受体血清 ,可利用免疫印迹法检测人、鼠组织和细胞中的天然极低密度脂蛋白受体及其亚型的蛋白。此结果提示 ,抗极低密度脂蛋白受体多克隆抗体的制备为从蛋白水平研究极低密度脂蛋白受体提供了有效的工具。

小亚璃眼蜱FER1基因的克隆表达及抗蜱效果

为挖掘抗蜱候选疫苗抗原,对蜱虫进行安全有效的防控。本研究旨在对小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)铁蛋白1(H.anatolicum ferritin1,HanFER1)基因进行生物信息学预测及分析,使用克隆技术和原核表达系统表达HanFER1,通过镍柱纯化法获取高纯度HanFER1,并对其进行模式动物免疫抗蜱试验。提取小亚璃眼蜱总RNA并反转录为cDNA,构建克隆载体pMD19-T-FER1和系统进化树,通过生物信息学分析其B细胞抗原性表位、跨膜区结构、亲疏水性、蛋白理化特性、信号肽和亚细胞定位;构建表达载体pET-28a-FER1,用His-Bind亲和层析柱获得纯化蛋白;使用rHanFER1免疫家兔,制备多克隆抗体,Western blot检测其免疫原性,用ELISA检测其抗体效价,待抗体效价升高后开展攻蜱试验。本试验中的小亚璃眼蜱FER1氨基酸序列与印度的小亚璃眼蜱(序列号:AFQ98383.1)为一支,且亲缘关系最近,相似达到约99%。B细胞线性抗原表位显示有较好的抗原性,该基因编码172个氨基酸,分子式为C_(878)H_(1 357)N_(237)O_(275)S_(9),相对分子质量为19.92 ku。理论等电点(pI)为5.13,为酸性蛋白;HanFER1蛋白无跨膜区信号肽;抗原性很高,为亲水性蛋白,并且HanFER1主要存在于细胞质(56.5%),其余分布在细胞核(26.1%)、线粒体(13.0%)。使用克隆技术克隆出了HanFER1基因片段长度为509 bp,成功构建了原核表达载体pET-28a-Ha-FER1,并经His-Bind镍柱亲和层析获得纯化HanFER1蛋白,FER1蛋白大小为25 ku,并且蛋白在浓度为0.8 mmol/L、最适温度为37℃的条件下诱导7 h左右表达量最高。Western blot结果显示该蛋白具有一定的免疫原性。ELISA结果显示rHanFER1免疫家兔的抗体效价为1∶12 800,rHanFER1蛋白免疫后总的抗蜱效果为73.43%,对小亚璃眼蜱的平均饱血蜱重、平均卵重及平均卵孵化率的抑制率分别为11.7%,23.0%和55.0%。本研究通过生物信息学分析、重组蛋白表达、血清学试验及抗蜱试验,发现HanFER1具有抗蜱疫苗候选抗原潜力,为HanFER1的功能研究奠定了基础。

边缘革蜱AQPs重组蛋白的表达及抗蜱效果

对边缘革蜱(Dermacentor marginatus)水通道蛋白(aquaporin,AQP)rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3纯化后免疫家兔,采血,进行Western blot和ELISA试验,第3次免疫2周后进行抗蜱试验。利用SDS-PAGE凝胶电泳筛选出rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3的最优表达条件,经HisSep Ni-NTA 6FF纯化柱将3种重组蛋白纯化,家兔分4组,每组3只家兔,对照组1组,免疫组3组。纯化的3种重组蛋白分别单独免疫3组家兔,在0、14、21d分别进行1次免疫,每隔7d采血1次,制备多克隆抗体,Western blot检测其反应原性,用ELISA检测其抗体效价,待抗体效价升高后开展攻蜱试验。结果显示,rDmAQP1的最优表达条件是IPTG浓度为1.0mmol/L、37℃诱导8h;rDmAQP2的最优表达条件是IPTG浓度为1.0mmol/L、37℃诱导7h;rDmAQP3的最优表达条件是IPTG浓度为1.0mmol/L、37℃条件下诱导5h。Western blot结果显示rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3都具有一定的反应原性。ELISA结果显示rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3免疫家兔的抗体效价分别为:1∶409600、1∶51200和1∶409600,rDmAQP1蛋白免疫后总的抗蜱效果为79.74%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为9.43%、25.17%和63.81%;rDmAQP2蛋白免疫后总的抗蜱效果为78.78%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为8.30%、20.14%和68.26%;rDmAQP3蛋白免疫后总的抗蜱效果为87.91%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为3.23%、22.47%和80.50%。本研究通过血清学试验及抗蜱试验,发现rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3都具有抗蜱疫苗候选抗原潜力,其中rDmAQP3的免疫效果最佳,为rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3功能研究奠定了基础。