福寿螺多功能纤维素酶基因egx的克隆及其体外功能性表达

【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。【方法】通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织总RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx序列,连接克隆载体pMD18-T,再通过Eco RⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体pET-32a(+)及pcDNA3.1(+)连接,构建原核、真核表达载体,并在E.coli BL-21(DE3)和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。【结果】RT-PCR扩增得到1 326 bp的序列,包括1 185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因cDNA序列相似性为99%,氨基酸序列相似性为100%。原核细胞表达产物经包涵体复性后,对羧甲基纤维素钠、2-羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、微晶纤维素、木聚糖的水解活性分别为:24.78、15.67、18.42、600.91和175.43 U.mg-1;而在PK15细胞中重组酶对以上5种底物的活性分别为:0.84、0.78、1.01、14.62和4.23 U.mL-1。【结论】克隆出了福寿螺多功能纤维素酶基因,并能在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功地表达。

转基因草菇高产多功能纤维素酶的培养条件

以转多功能纤维素酶基因(mfc)草菇子代中单孢分离获得的高产多功能纤维素酶菌株TVM186为研究对象,分析固态发酵对该工程菌株产多功能纤维素酶(MFC)的影响。通过单因素试验分析麸皮粉、大豆粉、香蕉皮粉等对MFC活性的影响,确定发酵主要影响因子为麸皮粉和大豆粉,适宜配比为质量比1∶1;利用均匀设计分析发酵条件对该菌株产MFC的影响,结果表明:草菇工程菌株TVM186固态发酵的适宜培养条件为:培养基起始pH值7.4,接种量6%,温度34℃,时间10 d,含水量64%,装料量18.5 g,其酶活力可达到木聚糖酶(Xylanase)1 427.38 U/g、内切-β-1,4-葡聚糖酶(CMCase)597.59 U/g。

福寿螺多功能纤维素酶(EGXA)的结构功能研究

利用点突变的方法构建了E332A、E332S和D290Q的多功能纤维素酶EGXA）的突变体，研究了在甲醇酵母中重组表达的突变体的酶学性质。结果表明：E332可能是该酶的活性必需基团，而D290Q突变体的外切葡聚糖酶及内切木聚糖酶活性均提高2～3倍，对EGXA研究及其应用提供了理论依据。

福寿螺多功能纤维素酶EGXA在酿酒酵母中的表达

研究在酿酒酵母中表达福寿螺内源性纤维素酶基因egxa cDNA。结果显示:重组酶水解对-硝基酚纤维二糖苷(pNPC)、微晶纤维素(sigmacell)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)以及Oat spelt的木聚糖(xylan from oatspelt,麦木聚糖)等4种底物的活力分别为1.25,84,70和196U/L,并发现了天然信号肽,酵母性因子信号肽(MFα1)对重组酶表达的影响。

利用pHsh载体克隆与表达多功能半纤维素酶

将来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)的双活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)基因构建到新型热激质粒pHsh上,得到质粒pHsh-xarB。将来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus DSM5826)的木聚糖酶A(XynA)基因构建到pHsh-xarB上,得到表达质粒pHsh-xarB-xynA。将重组质粒pHsh-xarB-xynA转入大肠杆菌Escherichia coli JM109进行表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子量为108 000,与理论值相符。Xyn-SDS-PAGE显示该融合酶具备木聚糖酶的活性。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性好,这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

利用pET-20b克隆与表达多功能半纤维素酶

将来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus,JW200)的双活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)构建到pET-20b(+)上,得到质粒pET-20b-xarB。将来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus DSM 5826)木聚糖酶A(XynA)构建到pET-20b-xarB上,得到表达质粒pET-20b-xarB-xynA。将重组质粒pET-20b-xarB-xynA转入大肠杆菌Escherichia coli JM109(DE3)进行表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子量为108 kDa,与理论值相符。

银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定

利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。

福寿螺(Ampullaria crossean)mfc基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中克隆多功能纤维素酶基因(mfc)。方法:设计引物,采用RT-PCR方法从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEMT-easy载体连接,转化大肠杆菌DH5α。结果:该基因全长为1225bp,上游5′端非翻译区19bp,3′端非编码区21bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)1185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8kDa。推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族。同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(Gen-Bank Accession No.AAP31839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异,在1个位点出现氨基酸差异。通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点,没有信号肽序列。结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因。