多功能T细胞的检测及其意义

近年来,在对小鼠实验和人体免疫的研究中发现,疫苗的保护效果和病人的预后及转归与多功能性T细胞的数量和质量密切相关。以往仅仅检测某种或少数几种效应T细胞的功能,远远不能代表机体的特异性免疫状态。在单个细胞水平上,同时产生两种或以上效应功能,包括细胞因子、趋化因子及杀伤功能的细胞被称为多功能性T细胞。多功能性T细胞与疾病的保护效果密切相关。为此,功能性T细胞的检测,能更准确、完整地反映机体特异性细胞免疫应答,尤其对于疫苗的设计和保护效果评价具有十分重要的意义。

结核胸液中ESAT-6多肽特异性多功能CD4^+ T细胞数量及功能分析

目的:检测ESAT-6多肽刺激后,结核性胸膜炎患者胸液细胞中CD4+ T细胞细胞因子产生及多功能CD4+ T细胞频率,了解ESAT-6特异性CD4+ T细胞在结核局部细胞免疫应答中的作用。方法:分离结核性胸膜炎患者胸液细胞(PFCs),ESAT-6混合多肽刺激后检测CD4+ T细胞细胞因子分泌、细胞亚群、多功能性CD4+T细胞频率及细胞因子平均荧光强度。结果:BCG、ESAT-6混合多肽和ESAT-6重组蛋白刺激PFCs后,主要是CD4+T细胞分泌Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2和TNF-α),而CD8+ T细胞几乎不产生细胞因子。进一步分析ESAT-6混合多肽刺激PFCs后Th1细胞的亚群组成,依据细胞因子分泌的类型及数量,该特异性Th1细胞可以分为7个不同亚群,且各亚群所占比例不同,其中多功能性T细胞亚群(同时分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α)比例较高。细胞因子荧光强度分析表明,依据细胞因子分泌类型的增加,单个细胞水平上不同Th1亚群中各细胞因子表达的量也逐渐增加,即3+>2+>1+细胞。结论:ESAT-6混合多肽刺激结核性胸膜炎患者胸液细胞后,主要诱导CD4+ T细胞分泌细胞因子,且Th1亚群中包含多功能性CD4+ T细胞,该细胞在单细胞水平上分泌细胞因子的类型和数量也显著高于其他亚群,可能在结核局部感染中发挥关键保护性作用。

结核患者多功能CD8T细胞的表达水平及临床意义

目的:探讨结核患者多功能CD8 T细胞的表达水平及其临床意义。方法:采用流式细胞术检测结核患者(TB)、潜伏感染者(LTBI)、健康对照(HC)外周血单个核细胞(PBMCs)或胸腔积液单个核细胞(PFMCs)结核特异性及非特异性多功能性CD8T细胞表达水平。结果 :非特异性抗原(PMA+I)刺激下,TB组PBMCs中多功能性CD8T细胞(IL-2+IFN-γ+TNF-α+CD8 T细胞)频率[(5.72±4.32)%]显著低于HC[(22.3±15.7)%(q=7.455,P<0.001)]和LTBI[(14.2±7.72)%,(q=3.110,P<0.05)];结核菌特异性抗原(MTB裂解液)刺激下,TB组PBMCs中多功能性CD8T细胞频率[(0.33±0.83)%]高于HC[(0.017±0.03)%(q=3.97,P<0.05)]和LTBI[(0.019±0.035)%,(q=3.39,P<0.05)];结核性胸膜炎患者PFMCs多功能CD8T细胞频率[(0.623±1.033)%]显著高于相应的PBMCs[(0.034±0.066)%,(P<0.001)];结核患者PBMCs多功能性CD8 T细胞表达水平和其HRCT评分呈负相关(r=-0.265 8,P=0.015 8)。结论:多功能CD8 T细胞表达水平检测有助于鉴别诊断结核患者和潜伏感染者,其与结核患者的病理损伤程度密切相关。

多功能性T细胞在感染控制中的作用

多功能性T细胞能够分泌多种细胞因子并具有增殖能力,在慢性感染中具有更强的免疫调节功能。T细胞反应的质量对于各种感染性疾病的预后具有关键的作用。了解不同T细胞亚群,特别是抗原特异性T细胞亚群在数量和功能方面的改变,对于感染性疾病的诊断和预后、各种感染和肿瘤的预防性或治疗性疫苗的研制具有非常关键的作用。

结核分枝杆菌H37Ra诱导核苷酸结合寡聚结构域2基因敲除(NOD2-/-)小鼠的1型辅助T（Th1）细胞型免疫应答

目的探讨1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)及多功能T细胞在感染结核分枝杆菌H37Ra的核苷酸结合寡聚结构域2基因敲除(NOD2-/-)小鼠中的作用.方法NOD2-/-小鼠与野生型C57BL/6小鼠气管分别滴入MTB减毒株H37Ra建立肺部感染模型并设立生理盐水对照组,每组10只.4周后,取肺组织进行HE染色及病理评分;ELISA检测肺组织匀浆中TNF-α和IFN-γ含量;流式细胞术检测脾细胞中多功能CD4+T/CD8+T细胞的比例.结果NOD2-/-小鼠感染H-37Ra后肺组织炎症加重,肺组织TNF-α和IFN-γ含量增加.与生理盐水组相比,两种小鼠感染后,CD4+/CD8+T细胞中TNF-α+、IFN-γ+单阳性细胞及TNF-α+IFN-γ+细胞均显著增加;与C57BL/6小鼠感染组相比,NOD2-/-小鼠感染组体内TNF-α+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞及IFN-γ+CD8+T细胞显著增加.结论H37Ra可诱导NOD2-/-小鼠的Th1细胞型免疫应答反应.

Ag85A DNA疫苗加强免疫显著提高卡介苗初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答

目的构建表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗，分析其加强免疫后提高卡介苗（BCG）初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答。方法以Mtb毒株H37Rv基因组DNA为模板，PCR扩增Ag85A抗原编码的结构基因并克隆至真核表达载体pVAXI中构建其DNA疫苗；接着，将纯化后的该DNA疫苗加强免疫BCG初免小鼠2针，以BCG和DNA单独免疫小鼠为对照，免疫8周后无菌分离脾淋巴细胞，分别应用IFN-yELISPOT和多因子胞内流式细胞术（intracellular staining）分析免疫小鼠的Mtb抗原特异性效应细胞免疫水平与分泌IFN-/TNF-a/IL-2的多功能CD4＋T细胞频率及其强度以及CD8＋T细胞免疫应答。结果与BCG免疫及DNA单独免疫组相比，Ag85ADNA加强免疫不仅能显著提高小鼠IFN-y＋TNF-a＋IL-2＋多功能T细胞，IFN-y＋IL-2＋、IL-2＋TNF-a＋双功能T细胞与IL-2＋单功能T细胞的频率以及IL-2的分泌能力，还能显著诱导小鼠产生更多分泌IFN-y和IL-2的CD8＋T细胞。结论本研究成功构建了表达Mtb免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗并分析了其免疫原性，证实了BCG初免-DNA加强的免疫策略可同时显著增强实验小鼠的Mtb抗原特异性CD4＋T和CD8＋T细胞应答水平，有利于提高BCG的免疫原性，为增强BCG逐渐下降的抗结核保护效果提供新思路。

抗结核治疗中特异性T细胞免疫反应动态分析及其临床意义

目前,抗结核的化疗方案包括2个月的强化期与4个月的巩固期,而治疗过程中特异性细胞免疫应答随细菌载量改变呈现的动态变化特征有可能成为治疗疗效的生物标志物,并为个性化治疗方案提供理论依据。为此,我们收集了9例活动性结核病患者治疗前,治疗2、4、6个月的外周血样本,采用酶联免疫斑点测定法(enzyme-linked immune spot assay,ELISPOT)测定了不同治疗阶段结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激下PBMC中分泌IFN-γ的细胞数量,同时分析了抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平以及多功能T细胞比例的动态变化特征。结果显示:随着治疗的深入,ESAT-6及CFP-10刺激患者PBMC后,释放IFN-γ的细胞数量显著下降(P<0.05)。CD4^+IFN-γ^+T淋巴细胞的比例在治疗前与治疗6个月时相比有下降趋势,且治疗后结果具有归一性;虽然多功能T细胞有重要抗结核作用,但在我们统计的患者治疗过程中的变化不明显。以上结果表明抗结核治疗过程中外周淋巴细胞抗原特异性释放IFN-γ的细胞数量与CD4^+IFN-γ^+T淋巴细胞的比例随着患者的病情好转呈现下降趋势,提示抗原特异性细胞免疫应答的动态变化谱与病原菌负荷下降存在密切关系,可能成为抗结核治疗过程中的免疫学标志物。

肺结核患者抗原特异性IFN-γ＋TNF-α＋T细胞的检测分析

目的研究肺结核患者与健康对照外周血T淋巴细胞中γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达情况，初步探讨多功能性T细胞在结核发病中的作用。方法分离外周血单个核细胞（PBMCs），与特异性结核抗原共培养后，用流式细胞仪检测外周血CD8＋、CD4＋T细胞以及CD8-CD8＋细胞中抗原特异性IFN-γ和TNF-α的表达情况。通过非参数检验比较患者与PPD阳性健康对照者之间的表达差异。结果根据细胞因子分泌的类型将每群细胞分成3个亚群，分别为两个单阳性细胞亚群（IFN-γ＋TNF-α＋或IFN-γ＋TNF-α＋）和一个双阳性细胞亚群（IFN-γ＋TNF-α＋）即多功能性细胞亚群。经统计学分析，肺结核患者三群细胞中抗原特异性多功能性细胞的比例均高于PPD阳性健康对照者（P=0．001，0．001和0．014），且对照组该亚群的比例大部分均在结核病患者均值以下。结论多功能性T细胞很可能在结核的疾病进展过程中发挥重要作用。