miR-424靶向FBXW7对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨miR-424靶向F-box和WD重复结构域7(F-Box and WD repeat domain containing 7,FBXW7)轴对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞增殖、凋亡的影响。方法以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测人正常骨髓浆细胞与MM细胞系MM.1S、RPMI 8226、U266中miR-424及FBXW7表达。体外培养U266细胞并随机分为对照组、miR-424抑制剂组(转染miR-424抑制剂)、FBXW7过表达组(转染FBXW7过表达质粒)、阴性对照组(转染miR-424阴性对照和空载质粒)、miR-424抑制剂+FBXW7敲低组(转染miR-424抑制剂和FBXW7siRNA)。以RT-qPCR实验检测miR-424及FBXW7表达;以Edu染色、TUNEL染色分别检测增殖、凋亡;以蛋白质印迹实验检测增殖相关蛋白(Cyclin D1、PCNA)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)与FBXW7蛋白表达。在裸鼠右腋皮下接种转染后的各组U266细胞来构建多发性骨髓瘤移植瘤裸鼠模型,检测其移植瘤生长情况并比较其21 d移植瘤体积。以双荧光素酶报告实验验证miR-424对U266细胞FBXW7的靶向调控作用。结果与人正常骨髓浆细胞相比,MM.1S、RPMI 8226、U266细胞miR-424表达升高(P<0.05),FBXW7 mRNA表达降低(P<0.05)。与对照组相比,miR-424抑制剂组、FBXW7过表达组细胞增殖率、Cyclin D1、PCNA及Bcl-2蛋白表达、21 d移植瘤体积降低(P<0.05),FBXW7mRNA表达、凋亡率、FBXW7和Bax蛋白表达升高(P<0.05);阴性对照组细胞各指标无显著差异(P>0.05)。与miR-424抑制剂组相比,miR-424抑制剂+FBXW7敲低组细胞增殖率、Cyclin D1、PCNA及Bcl-2蛋白表达、21 d移植瘤体积增大(P<0.05),FBXW7 mRNA表达、凋亡率、FBXW7和Bax蛋白表达降低(P<0.05)。miR-424可靶向下调U266细胞FBXW7表达。结论下调miR-424可通过上调FBXW7表达而抑制MM细胞增殖及在裸鼠体内生长,促使其凋亡。

circ_0061140靶向miR-338-3p调控多发性骨髓瘤细胞的增殖和凋亡

目的:研究环状RNA 0061140(circ_0061140)对多发性骨髓瘤Sko-007细胞增殖和凋亡的影响和调控机制。方法:采用生物信息学数据库预测circ_0061140的靶miRNA,双荧光素酶报告实验证实circ_0061140与miR-338-3p靶向关系。实时定量PCR分析健康对照者和多发性骨髓瘤病人外周血中circ_0061140和miR-338-3p表达。将circ_0061140小干扰RNA(si-circ_0061140)、miR-338-3p模拟物、si-circ_0061140联合miR-338-3p抑制剂分别转染Sko-007,采用CCK-8法、流式细胞术分析干扰circ_0061140或过表达miR-338-3p或同时抑制circ_0061140和miR-338-3p对Sko-007细胞增殖、凋亡的影响。蛋白质印迹法分析B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)和Bcl相关x蛋白(Bax)表达变化。结果:miR-338-3p是circ_0061140达靶基因。circ_0061140在多发性骨髓瘤病人血清中的表达显著高于健康对照者(P<0.01),miR-338-3p在多发性骨髓瘤病人血清中的表达显著低于健康对照者(P<0.01)。干扰circ_0061140表达后Sko-007细胞增殖活力、Bcl-2表达显著降低(P<0.01),miR-338-3p和Bax表达、细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。过表达miR-338-3p后Sko-007细胞增殖活力、Bcl-2表达显著降低(P<0.01),细胞凋亡率、Bax表达显著升高(P<0.01)。与干扰circ_0061140比较,同时抑制circ_0061140和miR-338-3p表达后Sko-007细胞增殖活力、Bcl-2表达显著升高(P<0.01),细胞凋亡率、Bax表达显著降低(P<0.01)。结论:circ_0061140通过靶向miR-338-3p促进多发性骨髓瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,在多发性骨髓瘤中具有致癌作用。

LINC01006靶向miR-331-3p调控多发性骨髓瘤细胞的增殖、凋亡和转移的机制研究

目的:探讨LINC01006靶向miR-331-3p在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)进展中的功能。方法:RT-qPCR检测39例MM患者和22例正常对照者骨髓标本来源的浆细胞中LINC01006和miR-331-3p的表达。分别转染si-LINC01006、si-NC、miR-331-3p mimics、miR-NC、si-LINC01006+anti-miR-NC、si-LINC01006+anti-miR-331-3p至MM细胞U266,通过CCK-8、流式细胞术和Transwell法评估U266细胞抑制率、凋亡率和转移数。DIANA Tools网站预测LINC01006与miR-331-3p的相互作用,并通过双荧光素酶报告基因法进一步验证。结果:MM患者骨髓标本来源的浆细胞中LINC01006表达升高,miR-331-3p表达降低。转染si-LINC01006可增加细胞抑制率和凋亡率(P<0.05),减少细胞转移数(P<0.05),并上调miR-331-3p表达(P<0.05)。转染miR-331-3p mimics可增加细胞抑制率和凋亡率(P<0.05),减少细胞转移数(P<0.05)。miR-331-3p与LINC01006直接结合。转染anti-miR-331-3p显著逆转转染si-LINC01006对MM细胞抑制率、凋亡率和转移数的影响。结论:沉默LINC01006通过促进miR-331-3p表达来抑制MM细胞增殖和转移,诱导凋亡,从而抑制MM进展。

PPP2R5C对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和药物敏感性的影响

目的探讨蛋白磷酸酶2调节亚基B′γ(protein phosphatase 2 regulatory subunit B′gamma,PPP2R5C)对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞增殖、凋亡和药物敏感性的影响。方法利用qRT-PCR和Western blot检测PPP2R5C在人MM细胞系(MM1S、RPMI-8226细胞系)和正常外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中的表达水平。在MM1S细胞中分别转染PPP2R5C干扰siRNA(si-PPP2R5C组)及其阴性对照-siRNA(si-CTRL组)、PPP2R5C过表达质粒(OE-PPP2R5C组)及其阴性对照(OE-CTRL组),利用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况。用不同浓度硼替佐米(bortezomib,BTZ)处理si-PPP2R5C组和si-CTRL组细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力并计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。用1 nmol/L的BTZ干预si-PPP2R5C组和si-CTRL组细胞24 h后,采用qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中BCL-2和BAX的表达水平,Caspase 3/7活性检测试剂盒检测Caspase 3/7活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果相较于PBMC细胞,MM1S、RPMI-8226细胞在mRNA和蛋白水平上均高表达PPP2R5C(均P<0.001)。与si-CTRL组相比,si-PPP2R5C组在培养48 h、72 h后细胞增殖活力均受到抑制(均P<0.001),凋亡率明显增加(5.97%vs 14.39%,P<0.001)。与OE-CTRL组相比,OE-PPP2R5C组在培养48 h、72 h后细胞增殖活力均增强(均P<0.01)。si-PPP2R5C组BTZ的IC50值相比si-CTRL组显著下降(3.40 nmol/L vs 10.37 nmol/L,P<0.001)。si-PPP2R5C+BTZ组相比于Control组和si-CTRL+BTZ组,BCL-2的mRNA和蛋白水平均下降,而BAX的mRNA及蛋白水平、Caspase3/7活性和细胞凋亡率则增加(均P<0.05)。结论PPP2R5C在MM细胞系中显著高表达,敲低PPP2R5C表达后可抑制MM细胞增殖并促进凋亡,以及增强BTZ的药物敏感性。

地西他滨联合安罗替尼对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨地西他滨联合安罗替尼治疗多发性骨髓瘤(MM)的生物学效应及可能的机制。方法:分别应用不同浓度的地西他滨、安罗替尼以及地西他滨+安罗替尼处理MM细胞系和原代细胞,CCK-8法检测两药对细胞增殖的影响,并计算协同指数,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测药物对c-Myc蛋白的影响。结果:地西他滨和安罗替尼单药均能有效地抑制MM细胞系NCI-H929和RPMI-8226的增殖,并且诱导细胞凋亡;两药联合组抑制细胞增殖和诱导凋亡的效果明显强于单药组。两药联合在原代MM患者细胞中也显示出较强的细胞毒性。地西他滨和安罗替尼能够下调MM细胞中c-Myc蛋白的水平,并且联合用药组的c-Myc水平最低。结论:地西他滨联合安罗替尼能够有效地抑制MM细胞的增殖并且诱导其凋亡,这为地西他滨联合安罗替尼治疗MM提供了一定的实验基础。

CircBACH1调节miR-140-5p/MDM2轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响

目的探讨CircBACH1对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响以及在此过程中对miR-140-5p/MDM2轴的调节机制。方法收集MM组和正常对照组骨髓浆细胞,将人MM细胞系U266细胞分为未转染(Control)组、si-NC组、si1-CircBACH1组、si2-CircBACH1组、si-CircBACH1+anti-miR-NC组、si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组。实时荧光定量PCR检测细胞中CircBACH1、miR-140-5p、鼠双微体2(MDM2)mRNA的表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡及对硼替佐米的敏感性;Western blot检测细胞中B细胞淋巴因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶(cleaved caspase)-3蛋白的表达;双萤光素酶报告基因实验验证CircBACH1、miR-140-5p、MDM2三者的靶向关系。结果与正常对照组相比,MM组的骨髓浆细胞及U266细胞中CircBACH1、MDM2 m RNA表达升高,miR-140-5p表达降低(P<0.05);与Control组和si-NC组相比,siCircBACH1组细胞中CircBACH1、MDM2的mRNA表达、细胞增殖活性、Bcl-2蛋白表达均降低,miR-140-5p的表达、细胞凋亡率、化疗敏感性及cleaved caspase-3、Bax表达均升高(P<0.05);而回补实验中,si-CircBACH1对MM细胞的影响被anti-miR-140-5p逆转,且MDM2的表达也升高(P<0.05)。双萤光素酶基因报告实验验证了CircBACH1、MDM2均与miR-140-5p存在靶向关系。结论敲低CircBACH1能够上调miR-140-5p表达,下调MDM2的表达,抑制MM细胞的增殖,促进MM细胞凋亡,提高化疗敏感性。

CD166对多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖、凋亡及自噬的影响实验研究

目的:探究CD166对多发性骨髓瘤(MM)RPMI-8226细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法:选取MM细胞RPMI-8226,设计并合成靶向CD166的短发夹RNA(shRNA)和阴性对照(NC)进行细胞转染,分为sh-CD166-1组、sh-CD166-2组和NC组。采用MTT法和平板克隆实验观察CD166对RPMI-8226细胞增殖能力和平板克隆形成能力的影响。利用流式细胞仪检测CD166对RPMI-8226细胞凋亡的影响。采用自噬实验观察CD166对RPMI-8226细胞自噬的影响。此外,将BALB/c裸鼠随机分为NC组和sh-CD166组,通过皮下移植瘤模型评估CD166对RPMI-8226细胞体内成瘤能力的影响。结果:sh-CD166转染后,显著抑制RPMI-8226细胞的增殖能力和平板克隆形成能力(均P<0.05)。与NC组比较,sh-CD166-1组和sh-CD166-2组细胞凋亡率升高(均P<0.05),但sh-CD166-1组和sh-CD166-2组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。与NC组比较,sh-CD166组细胞中自噬小体表达量明显减少(P<0.05)。此外,体内移植瘤模型结果表明,sh-CD166组体内成瘤能力比NC组显著降低(P<0.05)。结论:CD166能促进MM细胞RPMI-8226增殖,抑制细胞凋亡,并促进皮下成瘤。

冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡实验研究

目的探究冬凌草甲素对多发性骨髓瘤(MM)U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响。方法通过细胞培养和处理方法,采用0、10、20、30、40、50μmol/L的冬凌草甲素处理MM相关U266细胞、RPMI8226细胞48 h。采用MTT法测定U266细胞、RPMI8226细胞的增殖情况,采用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒检测U266细胞、RPMI8226细胞凋亡情况,并采用蛋白质印迹法测定Bax、Bcl-2蛋白表达。结果处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10~50μmol/L)的增加,U266细胞、RPMI8226细胞的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10~50μmol/L)的升高,促凋亡蛋白Bax表达量逐渐升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论冬凌草甲素具有抑制MM细胞增殖和诱导细胞凋亡的潜力,其作用机制可能与促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,改变细胞Bcl-2/Bax比例,调节细胞凋亡有关。

circ_NEK6/miR-503-5p对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的探讨circ_NEK6/miR-503-5p分子轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响及其可能的作用机制。方法选取2020年2月至2021年7月遵义医科大学第三附属医院收治的30例多发性骨髓瘤患者为研究组,同时选取在该院体检的55例健康志愿者为对照组;qRT-PCR法检测血清中circ_NEK6、miR-503-5p的表达量;体外培养人多发性骨髓瘤U266细胞,分为si-circ_NEK6组、miR-503-5p组和si-circ_NEK6+anti-miR-503-5p组以及相应的对照组(si-NC组、miR-NC组、si-circ_NEK6+anti-miR-NC组);细胞增殖、凋亡及迁移用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术与Transwell实验测定;双荧光素酶报告基因实验验证circ_NEK6与miR-503-5p之间的靶向关系;Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果与对照组比较,研究组患者血清中circ_NEK6高表达(P<0.05),miR-503-5p低表达(P<0.05);si-circ_NEK6组U266细胞miR-503-5p的表达、细胞增殖抑制率、凋亡率和Bax水平增加(均P<0.05),而克隆数、迁移数和Bcl-2水平降低(均P<0.05);circ_NEK6可靶向结合miR-503-5p;在miR-503-5p组U266细胞,细胞增殖抑制率、凋亡率和Bax水平上升(均P<0.05),而克隆数、迁移数和Bcl-2水平降低(均P<0.05);此外,si-circ_NEK6+anti-miR-503-5p组细胞增殖抑制率、凋亡率和Bax水平降低(均P<0.05),而克隆数、迁移数和Bcl-2水平升高(P<0.05)。结论敲低circ_NEK6可以通过靶向miR-503-5p降低多发性骨髓瘤细胞生长和迁移能力。

橘皮化合物5⁃ATAN诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其机制研究

目的探讨橘皮提取物(5⁃ATAN)对多发性骨髓瘤细胞U266增殖和凋亡的影响及其机制。方法用6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的5⁃ATAN处理对数生长期U266细胞24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位,Western blotting法检测细胞色素C、BCL⁃2、BAX、pro⁃caspase 3、pro⁃caspase 9及cleaved⁃caspase 3、cleaved⁃caspase 9、PARP、Bad、p⁃Bad的表达。结果5⁃ATAN对U266细胞的增殖有抑制作用,呈剂量依赖性(P<0.05);细胞凋亡率随药物浓度的增加显著增加(P<0.05),线粒体膜电位随5⁃ATAN浓度的增加显著降低(P<0.05)。抗凋亡蛋白Bcl⁃2、p⁃Bad及pro⁃caspase 3、pro⁃caspase 9及PARP的表达逐渐降低;细胞色素C及促凋亡蛋白Bax、cleaved⁃caspase 3、cleaved⁃caspase 9、PARP(89KDa)的表达逐渐升高(P<0.05)。结论5⁃ATAN抑制多发性骨髓瘤的增殖,促进其凋亡,可能与线粒体凋亡信号通路的激活有关。

野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响

目的探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用。方法将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)体外转染至RPMI8226细胞。通过MTT法检测细胞生长曲线,Hoechst33342染色检测细胞凋亡,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN及FAKmRNA水平变化,Western印迹检测PTEN、FAK及p-FAK蛋白变化,Transwell小室检测RPMI8226细胞侵袭能力。结果Ad-PTEN-GFP以感染复数为100转染RP-MI8226细胞后,第4天达到最大生长抑制率为42.01%,Ad-PTEN-GFP转染RPMI8226细胞72h后细胞凋亡率为(35.02±6.80)%,PTENmRNA及蛋白表达升高,FAKmRNA以及FAK、p-FAK蛋白表达下调,与Ad-GFP组相比差异显著(P<0.01,P<0.05);Transwell小室结果显示,转染Ad-PTEN-GFP组漏入下室内及黏附于下室面细胞数量较Ad-GFP组显著减少(P<0.01)。结论转染野生型PTEN基因的RPMI8226细胞增殖受抑,凋亡增加,细胞侵袭力明显减弱,其作用可能与下调FAK、p-FAK表达有关。

华蟾素对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞株增殖、凋亡的影响及机制研究

目的:探讨华蟾素对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞株增殖、凋亡的影响及作用机制。方法:分别采用四氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪检测华蟾素对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞增殖、凋亡的影响。用ELISA检测细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)及血管内皮生长因子(VEGF)水平。结果:1不同浓度华蟾素对RPMI 8226细胞的增殖均有抑制作用,随药物浓度的增加及作用时间的延长,药物的作用效果增强;2不同浓度华蟾素(0.0625、0.125、0.25、0.5μg/m L)作用于RPMI 8226细胞72h,细胞凋亡率分别为(14.92±1.59)%、(19.17±2.10)%、(19.43±2.63)%和(27.47±3.39)%,与对照组(2.98±0.67)%比较,差异有统计学意义(P<0.01)。0.5μg/m L浓度华蟾素凋亡率高于其于各组(P<0.01);3与对照组比较,不同浓度华蟾素作用于RPMI 8226细胞72h,细胞上清中IL-6及VEGF水平下降,其中高浓度华蟾素组(0.25及0.5μg/m L)的变化有显著性差异(P<0.01),但低浓度组(0.0625及0.125μg/m L)变化无统计学意义(P>0.05)。结论:华蟾素在体外具有抗多发性骨髓瘤的作用,并呈时间和剂量的依赖性,与其直接细胞毒作用及诱导凋亡有关,降低瘤细胞分泌IL-6及VEGF的水平可能是其作用机制之一。

G蛋白偶联受体激酶6对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:研究G蛋白偶联受体激酶6(G protein-coupled receptor kinase 6,GRK6)对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及其作用的机制。方法:收集多发性骨髓瘤患者标本及健康对照组标本作为体内试验研究对象。分离获得的原代多发性骨髓瘤浆细胞和骨髓瘤细胞系U266、NCI H929为体外试验细胞组。分别用Western blot和quantitative real-time PCR检测GRK6的蛋白表达和mRNA表达。用Brd U试剂盒测定骨髓瘤细胞在GRK6抑制剂CX-4945的处理条件下的增殖变化,应用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测其凋亡水平。结果:多发性骨髓瘤组中GRK6的表达明显高于对照组(P<0.05),在Ⅰ期的表达高于对照组,Ⅱ期高于Ⅰ期,Ⅲ期高于Ⅱ期(P<0.05)。GRK6在多发性骨髓瘤患者标本中蛋白和mRNA的表达均显著高于健康对照组。U266和MM细胞对抑制剂CX-4945呈现高敏性,而NCI H929对其敏感性低。GRK6 siRNA处理细胞后,GRK6在3组骨髓瘤细胞中的表达均显著下调。在细胞增殖检测实验中,CX-4945处理组U266、NCI H929和MM细胞增殖率分别为(58.25±18.24)%、(64.32±20.03)%和(45.42±25.01)%;凋亡检测中,U266、NCI H929和MM细胞凋亡率为(62.82±53.21)%、(43.25±47.05)%和(85.67±40.32)%。结论:多发性骨髓瘤GRK6的表达增强。GRK6抑制剂CX-4945能调节Rac1分子并抑制骨髓瘤细胞的增殖,促进其凋亡。GRK6参与骨髓瘤细胞的增殖和凋亡通路。

水仙提取物对人类多发性骨髓瘤细胞系ARH-77增殖和凋亡的作用

目的研究水仙提取物对人类多发性骨髓瘤细胞系ARH-77的增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法检测水仙提取物(1.25、2.5、5、10、20μg/mL)作用ARH-77细胞3d后细胞存活率的变化;采用荧光染色法观察水仙提取物(10μg/mL)作用3d对ARH-77细胞凋亡的影响;流式细胞仪分析细胞周期时相变化和检测细胞凋亡率;核仁组织区(NOR)相关嗜银蛋白(AgNOR)染色法检测细胞NOR的改变;透射电镜观察细胞亚微结构变化。结果水仙提取物能明显抑制ARH-77细胞增殖,降低细胞存活率(P<0.01),其IC50为4.8μg/mL;促进肿瘤细胞凋亡(P<0.05),阻滞细胞周期于G2/M期(P<0.01);降低AgNOR的数目(P<0.001)和促进AgNOR的融合(P<0.01);引起细胞亚微结构改变。结论水仙提取物能抑制ARH-77细胞增殖,诱导ARH-77细胞凋亡。

黄连素对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨黄连素对多发性骨髓瘤细胞活性和凋亡的影响。方法:通过CCK-8试验检测不同浓度黄连素作用下多发性骨髓瘤U266细胞的增殖;ELISA试验检测不同浓度黄连素作用下U266分泌IL-6的情况;细胞凋亡试验检测不同浓度黄连素作用下U266骨髓瘤细胞凋亡行为变化;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察U266细胞的超微结构。结果:随着浓度(40~160μmol/L)的改变,黄连素以剂量和时间依赖的方式抑制U266细胞细胞增殖和IL-6分泌;黄连素以剂量依赖的方式诱导U266细胞G2/M期停滞和凋亡,80μmol/L黄连素处理后的U266细胞的超微结构发生凋亡的形态特征。结论:黄连素能抑制人多发性骨髓瘤细胞的活性,诱导骨髓瘤细胞G2/M期停滞并诱导细胞凋亡。

大黄素衍生物E11的筛选及对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

目的:筛选抑制多发性骨髓瘤细胞增殖作用最强的衍生物,研究大黄素衍生物对两种多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226及U266细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用。方法:以大黄素为母体合成16种大黄素衍生物,从中筛选出大黄素衍生物E-11进行实验。应用MTT比色法及细胞集落形成实验观察大黄素衍生物E11对RPMI8226、U266细胞增殖的影响;应用DAPI染色法在荧光显微镜下观察大黄素衍生物作用后的细胞形态变化;应用DNA片段化检测大黄素衍生物E11诱导细胞凋亡的作用。结果:MTT结果显示,16种大黄素衍生物作用于RPMI8226细胞48 h后,除了E10、E15无法计算外,其余14种半数抑制浓度(IC50)在0. 83-34. 68μmol/L之间。MTT结果显示,大黄素衍生物E11作用于RPMI8226、U266细胞48 h的IC50分别为0. 831±0. 045μmol/L和1. 039±0. 093μmol/L。细胞集落形成实验均显示,大黄素衍生物E11能抑制2种细胞集落的形成,在一定范围内呈浓度及时间依赖性(r=0. 72)。DAPI染色后在荧光显微镜下能看到大黄素衍生物E11作用后的RPMI8226、U266细胞出现典型的凋亡形态学改变;应用DNA片段化可观察到典型的DNA凋亡梯带。结论:在合成的16种大黄素衍生物中,E11对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的抑制增殖作用最强。大黄素衍生物E11对RPMI8226、U266细胞有明显的抑制增殖、诱导凋亡的作用。

UbcH10基因沉默对多发性骨髓瘤U-1996细胞增殖和凋亡的作用研究

目的采用脂质体法转染siRNA的方法沉默多发性骨髓瘤U-1996细胞中的UbcH10基因,研究基因沉默后U-1996细胞增殖活性及凋亡等生物学特性的变化情况。方法根据UbcH10基因信息,设计针对UbcH10基因编码序列(CDS)区的siRNA序列。通过脂质体法转染相关siRNA序列至多发性骨髓瘤U-1996细胞。在转染siRNA后48h,采用实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹法检测U-1996细胞中UbcH10基因的mRNA和其蛋白水平。选取未转染siRNA序列的空白组和转染阴性siRNA序列组作为试验对照,采用CCK-8法检测转染siRNA序列后24、48、72hU-1996细胞的增殖情况,采用流式细胞术检测48h后U-1996细胞的凋亡情况。结果通过脂质体法成功转染构建siRNA序列至U-1996细胞。转染后的U-1996细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白表达情况较转染前均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。和对照组相比,沉默UbcH10基因后U-1996细胞的增殖活性下降,差异有统计学意义(P<0.05),细胞凋亡率上升,差异也有统计学意义(P<0.05)。结论干扰UbcH10基因表达可显著抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖活性并增加细胞凋亡。

藤黄酸对多发性骨髓瘤细胞株NCI-H929增殖和凋亡影响

目的探讨藤黄酸对多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其分子学机制,为其临床治疗多发性骨髓瘤提供依据。方法用不同浓度的藤黄酸处理多发性骨髓瘤细胞株NCI-H929细胞,采用MTS法检测藤黄酸对多发性骨髓瘤细胞活性的影响;碘化丙啶单染法于荧光显微镜下观察细胞形态的变化;应用Western blot法检测泛素蛋白酶体系统相关蛋白(泛素-蛋白酶体系统蛋白(Ubs)、B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子α、B细胞淋巴瘤因子相关蛋白(Bax))、凋亡相关蛋白(聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3前体(Pro-caspase3)、髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、B细胞淋巴瘤-白血病-2蛋白(Bcl-2)及信号转导和转录激活因子5(STAT5))表达情况。结果藤黄酸明显抑制NCI-H929细胞的活力,诱导NCI-H929细胞凋亡;随藤黄酸浓度升高,Ubs聚集,Bax表达升高,蛋白酶体系统受到抑制;随藤黄酸浓度升高与作用时间延长,PARP出现切割,凋亡相关蛋白Pro-caspase3、Mcl-1、XIAP、Bcl-2及增殖通路蛋白STAT5表达下调。结论藤黄酸能够抑制多发性骨髓瘤细胞株NCI-H929的蛋白酶体活性,影响凋亡相关蛋白的表达,促进细胞凋亡。其机制可能通过抑制JAKs/STATs信号转导通路的活化,抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。

TLR4参与多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡作用研究

目的:探讨TLR4信号对多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法:用RT-PCR和PE染色流式细胞仪检测骨髓瘤细胞株中TLR4基因的转录和蛋白的表达情况;MTT法检测细胞在脂多糖(LPS)刺激下增殖变化;AnnexinV-PI双染色流式检测细胞经LPS预处理后对阿霉素诱导的细胞凋亡的影响。结果:骨髓瘤细胞株中存在TLR4基因的转录和蛋白的表达,但表达水平有差异。骨髓瘤细胞在LPS刺激下,表达TLR4的MM1-s细胞增殖明显(P<0.05),对阿霉素诱导的凋亡有明显的抵抗作用;而不表达TLR4的U266细胞增殖未受明显影响。而且LPS不能保护阿霉素对U266细胞的诱导凋亡作用。结论:TLR4信号对在多发性骨髓瘤的增殖和生存都起重要作用。

DOCK1通过AMPK/mTOR通路对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的调控机制研究

目的探讨胞质分裂作用因子1(dedicator of cytokinesis 1,DOCK1)在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中的表达及其对癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响及相关机制。方法选取MM患者骨髓组织及人MM细胞株U266和RPMI 8266进行研究,采用实时荧光定量PCR(real time-quantitative PCR,RT-qPCR)法检测MM骨髓组织及细胞中DOCK1相对表达;构建敲低DOCK1表达细胞系,采用CCK-8法和流式细胞术检测DOCK1对MM细胞增殖与凋亡的影响;Western blot实验检测细胞增殖相关蛋白(c-Myc,cyclin D1)、凋亡相关蛋白(Bax,Bcl-2)、自噬相关蛋白(LC3-II/LC3-I,P62)及AMPK/mTOR通路相关蛋白的表达水平。结果LV-DOCK1-shRNA2组的U266和RPMI 8266细胞增殖率在24,48和72h均显著低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(F_(U266)=21.130~100.108,F_(RPMI8266)=35.067~95.677,均P<0.001)。LV-DOCK1-shRNA2组的U266和RPMI 8266细胞增殖相关蛋白c-Myc,cyclin D1表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组(F_(U266)=56.061,71.584;F_(RPMI8266)=93.248,62.146,均P<0.001)。LV-DOCK1-shRNA2组的U266,RPMI 8266细胞24h,48h凋亡率显著高于阴性对照组和空白对照组(F_(U266)=77.051,61.533;F_(RPMI8266)=60.868,68.306,均P<0.001)。与空白对照组和阴性对照组比较,LV-DOCK1-shRNA2组U266和RPMI 8266细胞凋亡相关蛋白Bax表达水平明显升高,Bcl-2表达水平明显降低(F_(U266)=92.588,21.940;F_(RPMI8266)=82.736,14.511,均P<0.05);自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达水平明显升高,P62表达水平明显降低(F_(U266)=147.1,26.342;F_(RPMI8266)=173.300,31.477,均P<0.05)。LV-DOCK1-shRNA2组U266,RPMI 8266细胞AMPK/mTOR通路相关蛋白p-AMPK表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(F_(U266)=40.542,F_(RPMI8266)=40.892,均P<0.05);p-mTOR表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(F_(U266)=38.707,F_(RPMI8266)=43.002,均P<0.05)。在LV-DOCK1-shRNA2组再次转染DOCK1过表达质粒使其表达恢复后,p-AMPK和p-mTOR表达水平也被逆转得到恢复。结论DOCK1在多发性骨髓瘤细胞中具有促癌作用,其机制可能与通过抑制AMPK/mTOR通路,抑制多发性骨髓瘤细胞的凋亡和自噬有关。