多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9磷酸酶产生的细胞定位及营养条件优化

为研究多噬伯克霍尔德氏菌Burkholderia.multivorans WS-FJ9的解有机磷机制,对该菌磷酸酶产生的细胞定位进行了探讨并对其降解有机磷的营养条件进行了优化。采用冰浴超声破碎及液体培养的方法对WS-FJ9胞外、胞内及膜周质提取液的磷酸酶活性及不同营养条件下磷酸酶活性和解磷量分别进行了测定。结果表明:多噬伯克霍尔德氏菌Burkholderia.multivorans WS-FJ9能分泌酸性和碱性磷酸酶且以分泌酸性磷酸酶为主,均定域为胞外酶;该菌株解有机磷的最适碳、氮和磷源分别为葡萄糖、硫酸铵和卵磷脂,降解培养基中卵磷脂的最适浓度为0.5 g/L。研究结果为生物菌肥的开发与利用提供了理论参考依据,对可持续农业的发展具有重要意义。

多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9对草甘膦的降解特性

长期或不当施用草甘膦会对非靶标生物和环境造成破坏作用。微生物是生物修复的重要生物资源,利用微生物及其产生的降解酶处理环境中有机磷农药的方法,已显示出良好的应用前景,是近年来研究有机磷农药降解的主要发展方向。研究分离松树根际土壤的高效解磷细菌多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对草甘膦的降解特性及其降解条件的优化。采用添加不同浓度草甘膦NA平板接种WS-FJ9菌株观察其对草甘膦的耐受性;分别以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源,探讨WS-FJ9菌株对草甘膦的利用状况;采用低进水量间歇式反应器法(FBR)测定了WS-FJ9菌株降解草甘膦动力学参数;利用Plackett-Burman(PB)、Central Composite Design(CCD)试验设计及响应面分析法(RSM)筛选与优化影响WS-FJ9菌株降解草甘膦的主要因素。WS-FJ9菌株有效降解草甘膦的最大耐受浓度为0.4%;WS-FJ9菌株在以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源培养基上均能正常生长;WS-FJ9菌株对草甘膦的亲和性常数(K s值)为65μL/mL,对草甘膦降解的极限浓度(S min)为21.9μL/mL;通过PB试验,筛选出3个影响菌株降解草甘膦的关键因素为培养温度、葡萄糖及硫酸铵的加入量,通过CCD设计及响应面法优化分析得到影响草甘膦降解率的关键因素的二阶模型,确定了WS-FJ9菌株降解草甘膦的最优实验操作条件为:培养温度27.7℃,葡萄糖和硫酸铵的加入量分别为0.67、0.50 g/L。实验条件下WS-FJ9菌株对草甘膦的降解率最高为72.83%。

多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9对林木病原菌物的拮抗作用及代谢产物的稳定性

【背景】伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)是一类重要的植物根际促生细菌,许多菌株具有抑制植物病原菌生长和促进植物生长等功能。【目的】探究高效解磷促生细菌多噬伯克霍尔德氏菌(B. multivorans) WS-FJ9对不同林木病原菌物的抑菌作用。【方法】采用平板对峙法检测菌株WS-FJ9对5株林木病原真菌和卵菌的抑制效果;基于比色法检测经菌株WS-FJ9处理后病原菌菌丝细胞内含物的变化;使用antiSMASH 5.0在线预测网站对其次生代谢物质进行预测;通过菌丝生长抑制速率法对其无菌发酵滤液的抑菌活性和稳定性进行研究。【结果】菌株WS-FJ9对5种林木病原菌均具有不同程度的抑制作用,其中菌悬液对樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)的抑制作用最好,抑菌带宽度为14.82±0.20mm,无菌发酵滤液对真菌拟茎点霉(Phomopsismacrospore)和松杉球壳孢(Sphaeropsis sapinea)的抑制效果显著,抑菌率分别为62.22%和62.78%;经无菌发酵滤液处理后的病原菌菌丝内的丙二醛含量增高,还原糖和可溶性蛋白含量显著降低。WS-FJ9菌株的基因组中含27个不同的次级代谢产物编码基因簇,其中包含编码嗜铁素、细菌素和抗生素等抑菌基因簇;该菌株发酵液在高温、紫外照射和强酸强碱环境条件下及经蛋白酶处理后,其抑菌活性均未受到影响。【结论】多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9对林木病原菌物具有很好的生防潜力。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染RAW264.7细胞模型的建立

目的建立类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础。方法摸索类鼻疽伯克霍尔德氏菌培养条件、构建模型的感染条件(e.g.感染复数,感染时间),通过吉姆萨染色、透射电镜、活细胞工作站动态观察等确证胞内感染和宿主细胞的形态变化,分析病原菌侵袭率、胞内复制率和宿主反应性来评价该模型中病原菌侵入RAW264.7特点和病理损伤类型。结果确定了类鼻疽伯克霍尔德氏菌的一般培养条件,感染复数MOI=100感染宿主细胞,170g离心5min后37℃共孵1h以利于细菌侵入胞内,含250μg/ml卡那霉素的DMEM-10培养以杀死胞外病原菌。形态观察,类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染后最早8h可观察到异物多核巨细胞(MNGC),RAW264.7细胞伸出伪足,相互融合。感染初期(<3h)TNF-α升高较快,9h后则下降至低值,直至感染后期(15～24h)再次升高。结论成功构建类鼻疽伯克霍尔德氏菌胞内感染模型,拟为进一步研究其致病机制提供了条件。

杨树根际土自毒物质的积累、毒害及生物修复

为研究杨树根际土壤中自毒物质的积累规律及其对杨树幼苗的毒害,分析多噬伯克霍尔德氏菌(Burkhold-eria multivorans)WS-FJ9对杨树自毒作用的生物修复特性,采用HPLC对1～5年生杨树根际土中的自毒物质进行测定;参照3年生杨树根际土壤中的自毒物质含量(设为X),在Hoagland营养液中设置4个自毒物质处理梯度(0.5X、1.0X、2.0X、3.0X),处理后第20天对水培苗进行施菌处理并继续培养至第30天分别采集根系样品进行生理生化指标的测定,同时测定了B.multivorans WS-FJ9降解自毒物质的速率。结果发现:不同林龄杨树根际土壤中均检测出对羟基苯甲酸、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、肉桂酸等自毒物质;不同浓度的自毒物质均可抑制杨树水培幼苗根系SOD及POD的活性,增加根系细胞膜透性及细胞的MDA含量、降低根系活力;而B.mul-tivorans WS-FJ9处理能提高杨树水培幼苗根系SOD及POD的活性,降低根系细胞膜透性及MDA含量,增加根系活力;B.multivorans WS-FJ9对供试的5种自毒物质均具有较强的降解能力,其中对香草醛和对羟基苯甲酸的降解能力为最强,降解率分别达到98.73%和96.32%。