10株绿僵菌菌株分类地位的多基因系统进化分析

为确定10株高效杀虫绿僵菌菌株的分类地位,通过克隆、测序10株绿僵菌菌株的ef1-α、rpb1、rpb2、β-tubulin部分序列进行多基因系统进化分析,并结合形态特征确定10株绿僵菌菌株的分类地位。结果表明多基因分子鉴定在绿僵菌菌种的划分上较单基因更为准确,结合多基因系统进化分析结果和形态学特征,将CQMa114、CQMa117、CQMa125、CQMa126、CQMa128归为大孢绿僵菌,CQMa102归为蝗绿僵菌,CQMa132、CQMa135归为贵州绿僵菌,菌株CQMa138、CQMa140与其他绿僵菌亲缘关系较远,有可能为绿僵菌属的新种或新的分类单位。

马铃薯Y病毒多基因系统发育分析及其在株系鉴定中的应用

为实现马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)常见株系的快速鉴定,本文以PVY的P1、HC-pro、VPg和CP 4个基因为研究对象建立了快速准确的多基因联合体系。根据基因的不同组合建立5个不同数据集,分别进行系统发育分析,并通过贝叶斯标签关联显著性(Bayesian tip-association significance,Ba TS)分析各数据集中代表分离物与株系的关联性,以确定实现PVY快速鉴定的最佳组合。不同数据集的系统发育及Ba TS分析结果显示,除了联合P1、VPg和CP 3个基因数据集外,其他4个数据集均无法实现PVY常见株系的准确鉴定。采用不同建树方法对联合P1、VPg和CP 3个基因数据集比较分析显示,基于ML法和NJ法的系统发育树在拓扑结构上基本一致,均优于基于贝叶斯算法的最大分支置信(maximum clade credibility,MCC)树。同时,以HLJ26分离物为研究对象,对建立的多基因联合体系进行实际应用,结果显示该分离物与PVY^(NTN-NW)株系的3个分离物SYR-Ⅱ-2-8、SYR-Ⅱ-Be1和SYR-Ⅱ-Dr H以高置信值聚为一亚簇,表明该分离物可能属于PVY^(NTN-NW)株系(SYR-Ⅱ型)。重组分析显示,HLJ26基因组存在4个潜在的重组信号,分别位于P1、HC-pro/P3、VPg和CP的5￠-末端,与PVY^(NTN-NW)株系(SYR-Ⅱ型)的重组位点相一致,表明其属于PVYNTN-NW株系(SYR-Ⅱ型)。同时,应用多重RT-PCR成功扩增出约为1000 bp和400 bp的2个特异性片段,与PVY^(NTN-NW)株系(SYR-Ⅱ型)的特异条带大小相一致。这些结果进一步支持了多基因联合体系的鉴定结果。联合P1、VPg和CP 3个基因数据集系统发育分析,可以实现PVY常见株系的准确鉴定。

甜樱桃采后主要真菌病害的分离鉴定及致病力分析

为进一步探究甜樱桃果实采后病原真菌的种类,本研究对甜樱桃采后果实发病部位的病原真菌进行分离纯化,对引起果实不同腐烂症状的5种病原菌进行形态学观察,并结合多基因序列分析鉴定病原菌。结果表明,菌株YTS6为扩展青霉(Penicillium expansum),YTS13为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),YTS21为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),YTS28为链格孢菌(Alternaria alternata),YTS37为枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides),其中枝状枝孢(C.cladosporioides)系首次报道为甜樱桃果实病原菌。致病力测定结果表明,YTS6、YTS13、YTS21和YTS28均对砂蜜豆有强致病力,YTS37对砂蜜豆有中等致病力;YTS13对萨米脱和奇好有强致病力,对拉宾斯和雷尼有中等致病力;YTS37对拉宾斯具有弱致病力,而对其余品种甜樱桃有中等致病力。不同属病菌对同一品种及同一病菌对不同品种甜樱桃的致病力均具有差异。本研究可为甜樱桃采后贮藏保鲜技术研究提供理论依据。

GenomeLab-(TM) GeXP检测rhIL-24联合顺铂对肺癌细胞凋亡相关基因表达的影响

目的探讨重组人白细胞介素24(rhIL-24)联合顺铂(DDP)诱导人肺腺癌A549细胞凋亡相关基因的变化。方法用160 ng/m L rhIL-24、3μg/m L DDP及160 ng/m L rhIL-24联合3μg/m L DDP处理A549细胞,应用Genome LabTMGe XP多基因遗传表达分析系统检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、存活蛋白(survivin)、caspase-3、视网膜母细胞瘤基因(Rb)、p53的mRNA表达水平。结果 rhIL-24蛋白处理的A549细胞上调Bax、caspase-3、Rb的mRNA水平,下调Bcl-2、survivin的mRNA水平,但p53mRNA变化无规律,rhIL-24联合DDP组对A549细胞上述基因表达的影响更明显。结论 rhIL-24蛋白可通过上调Bax、抑癌基因Rb,下调Bcl-2、survivin,激活caspase-3而诱导人肺腺癌A549细胞凋亡。

GeXP检测rhIL-24联合DDP对人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡相关基因的实验研究

目的:利用多基因遗传表达分析系统(GeX P)探讨重组人白细胞介素-24(rhI L-24)联合顺铂(DDP)诱导人肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞6个凋亡相关基因的变化。方法:用rhI L-24、DDP及rhI L-24+DDP干预A549/DDP细胞,应用多基因遗传表达分析系统(GeX P)同时检测Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、Rb与P53等6个凋亡相关基因。结果:rhI L-24蛋白可引起A549/DDP细胞Bax基因、Caspase3基因、Rb基因转录上调;Bcl-2基因、Survivin基因转录下调,但抑癌基因P53变化无规律,rhI L-24联合DDP后Bax、Survivin、Rb表达较单独rhI L-24组变化更加显著。结论:rhI L-24蛋白可通过上调Bax,下调Bcl-2、Survivin,激活Caspase3,上调抑癌基因Rb诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡。

基于ITS及GPD序列分析对贵州紫花菌的分类鉴定

明确贵州省紫花菌分类地位,对其人工驯化、加工及活性物质开发利用提供理论支撑。在贵州4个具有代表性的紫花菌产地附近的农贸市场,收集紫花菌样本进行组织分离,利用形态学结合分子系统学的方法进行鉴定。通过分离纯化获得20株菌株,根据子实体形态特征,在贵州市场收集的紫花菌主要分为两类,一类形态特征与鲜艳乳菇(Lactarius vividus)一致,另一类形态特征与红汁乳菇(L. hatsudake)一致。基于ITS和GPD基因序列的遗传距离和系统发育分析,显示分离获得的15株菌株与鲜艳乳菇(L. vividus)的遗传距离为0,在系统发育树上以较高的自举支持率与鲜艳乳菇(L. vividus)聚为一支,将15株菌株鉴定为鲜艳乳菇(L. vividus);5株菌株与红汁乳菇(L. hatsudake)的遗传距离为0,在系统发育树上与红汁乳菇(L. hatsudake)聚为一支,自举支持率为100%,将5株菌株鉴定为红汁乳菇(L. hatsudake)。笔者在贵州市场上收集到的紫花菌中没有鉴定出松乳菇(L. deliciosus),可能与近年松乳菇采集过度或因环境改变导致其发生量减少有关,也有可能是松乳菇与鲜艳乳菇、红汁乳菇形态较为接近,不易区分导致错误鉴定有关。

甘肃省辣椒炭疽病病原菌鉴定

以从甘肃省兰州市安宁区采集疑似辣椒炭疽病的发病辣椒果实为试材,采用组织分离法分离病原菌,通过构建多基因联合系统发育树,结合形态学和柯赫氏法则鉴定兰州市辣椒炭疽病病原真菌种类,以期为该病的诊断和防控提供参考依据。结果表明:从具有典型症状的病果上分离得到13株具有相同培养性状的菌株,柯赫氏法则明确代表菌株CA1902为辣椒炭疽病的致病菌;通过ITS、TUB2、ACT、CHS-1、HIS3和GAPDH构建多基因联合系统发育树,该菌株与松针炭疽菌Colletotrichum fioriniae聚在同一分支,且支持率为100%。综合可知,甘肃省兰州市安宁区辣椒炭疽病病原菌种类为松针炭疽菌C.fioriniae,是该种引起甘肃地区辣椒炭疽病的首次报道。考虑到辣椒的经济价值,可依据该鉴定结果制定有效的病害防控措施。

酒瓶椰子叶枯病病原菌鉴定

【目的】近年来,福建省厦门市园林植物园内的酒瓶椰子频发叶枯病,影响了植株的正常生长,降低了酒瓶椰子的观赏价值。为了更好地防控酒瓶椰子叶枯病,对引起该病害的病原菌进行了种类鉴定。【方法】从厦门市园林植物园收集了12份染病的酒瓶椰子叶片样品,通过分离和纯化,得到5个类拟盘多毛孢属真菌菌株。结合其形态特征和基于3个基因(ITS、TUB2和TEF1)的系统发育分析结果将这5个菌株鉴定到种。最后用柯赫氏法则验证所得菌株的致病性。【结果】这5个菌株被鉴定为Neopestalotiopsis cubana、Pestalotiopsis diploclisiae、P.humicola、P.neolitseae和Pseudopestalotiopsis theae。柯赫氏法则验证结果显示,N.cubana、P.diploclisiae、P.humicola和Ps.theae可以引起酒瓶椰子叶片发病,而P.neolitseae不能侵染酒瓶椰子的叶片。【结论】N.cubana、P.diploclisiae、P.humicola和Ps.theae是引起酒瓶椰子叶枯病的病原菌。这是新拟盘多毛孢属(Neopestalotiopsis)和假拟盘多毛孢属(Pseudopestalotiopsis)真菌在酒瓶椰子上的首次报道。其中,N.cubana为我国首次发现。

桂花叶斑病病原菌的鉴定、生物学特性及防治药剂筛选

【目的】桂花叶斑病严重影响桂花的观赏价值,为明确其病原菌,并筛选出可用于防治桂花叶斑病的杀菌剂。【方法】从福州市金山公园采集桂花叶斑病样品,切片镜检,采用组织分离法获得真菌菌株,通过柯赫氏法则验证所获菌株是否为桂花叶斑病的致病菌;综合形态特征和多基因(ITS、TUB、TEF、CAL和HIS)序列的系统发育分析将该菌鉴定到种;在此基础上,测定了该菌的生物学特性,采用含药平板法测定了4种杀菌剂对病原菌的毒力。【结果】明确了菌株FZ-GH-1是福州桂花叶斑病的病原菌,其被鉴定为Diaporthe grandiflori;FZ-GH-1在12 h光暗交替和全黑暗条件下菌丝生长速率最快,生长最适温度为24~28℃,最适p H值为5.0,生长所需最适碳源为葡萄糖,最适氮源为硝酸钠和蛋白胨;在供试药剂中,70%甲基硫菌灵可湿性粉剂和450 g/L咪鲜胺水乳剂对FZ-GH-1菌丝生长的EC50分别为0.108 mg/L和0.053 mg/L,明显低于30%代森锰锌可湿性粉剂和20%三唑酮乳油。【结论】确定了福州桂花叶斑病的病原菌为Diaporthe grandiflori,甲基硫菌灵和咪鲜胺对该菌抑制作用强,研究结果可为后续研究桂花叶斑病的发病规律和化学防治提供理论依据。

山东省侧柏枝枯病病原菌鉴定及其致病性测定

[目的]明确引起山东省济南市侧柏枝枯病的病原菌种类,为该病的防控提供依据。[方法]采用组织分离法和单孢分离法进行病原分离纯化,通过形态学和多基因系统发育分析(ITS、TEF-1α、TUB2)相结合的方法对分离菌株进行鉴定,通过人工接种测定其致病性。[结果]菌落初期白色,菌落中间簇状,后期菌落深灰绿色,背面黑褐色。分生孢子单孢透明,梭形、椭圆形、卵球形。根据形态特征和多基因系统发育分析将分离菌株鉴定为Neofusicoccum occulatum Sakalidis,M.L.,Burgess,T.I.。人工接种分离菌株,均可以引起侧柏枝条、鳞叶发病,症状与田间一致。从发病部位同样可以分离获得接种菌株。[结论]明确了N.occulatum是引起山东省济南市林场侧柏枝枯病的致病菌。

一种暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense引起的枣炭疽病

炭疽病是枣生产中的一类重要的真菌性植物病害,近以来,在山东省枣园内发生危害,造成严重损失。本文利用ITS、GAPDH、CHS-1、ACT、CAL、TUB2等6个保守基因序列进行多基因系统分析并结合形态学特征及致病性试验,确定了引起枣炭疽病的病原菌为暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)。这是暹罗炭疽菌侵染枣引起枣炭疽病的首次报道。

茶树炭疽病病原鉴定

【目的】明确福建省福州市茶树炭疽病病原菌种类,为茶树炭疽病的防治及抗病育种提供参考。【方法】采用形态学结合基于谷氨酰胺合成酶(GS)、β-微管蛋白(β-TUB2)、核糖体DNA内转录间隔区(r DNA-ITS)和核糖体DNA大亚基(LSU)等4个基因序列的多基因系统发育分析方法,对从福州市几个茶园不同茶树品种炭疽病典型病叶上分离获得的茶树炭疽病病原菌(FFB、FJG、FRG、FSX和FFA)进行鉴定,并利用柯赫氏法则验证菌株的致病性。【结果】5株供试病原菌均能通过伤口侵染茶树叶片,且病症相似,为茶树炭疽病致病菌。5株病原菌分离物形态特征相似,基于多基因系统发育分析并结合其形态学特征,将5株供试菌株鉴定为Colletotrichum siamense。【结论】C.siamense为茶树炭疽病弱致病菌,主要通过伤口侵染茶树。生产中应尽量避免人为活动造成茶树叶片损伤,以减少茶树发生炭疽病。

多基因表达系统在禽流感、登革及基孔肯雅病毒检测中的应用研究

目的该研究利用多重基因表达分析系统(GeXP)检测平台,建立禽流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒,基孔肯亚病毒的检测技术方法。方法制备病毒标准品质粒,收集病原体样本,利用GenBank下载病毒的核苷酸序列,根据病毒的序列特征,利用GeXPeXpress Profiler设计特异性引物,优化条件使GeXP系统能够特异性的检测对应病毒。结果优化后的引物能够同时检测禽流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒和基孔肯亚病毒病毒,特异性强,无交叉反应。结论GeXP检测方法的建立为快速检测禽流感病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒提供了便利,对分子诊断有重要意义。

多基因表达系统在蚊媒传染病检测中的应用研究

目的多基因表达分析系统(gene expression profiler genetic analysis system, GeXP)检测特异性强,检测速度和灵敏度明显提高。本研究利用GeXP检测平台,建立裂谷病毒、登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒的检测技术方法。方法 根据病毒的序列特征,利用GeXP eXpress Profiler设计特异性引物,优化条件使GeXP系统能够特异性的检测对应病毒。结果 优化后的引物能够同时检测裂谷病毒、登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒,产物经GeXP系统检测,4个峰值分别位于370.31bp、329.75bp、284.36bp和247.52bp,符合4种病毒PCR产物条带大小,特异性强,无交叉反应。结论 GeXP系统能够用于蚊媒传染病高通量检测工作,对分子诊断有重要意义。

福建李叶斑病病原菌种类鉴定及致病性研究

【目的】鉴定明确近年在福建新发生的李叶斑病的病原菌种类。【方法】采集李叶斑病叶进行组织分离,对获得的菌株采用形态学和分子生物学相结合的方法进行种类鉴定和致病性研究。【结果】通过组织分离和纯化,并根据菌落形态特征共获得66个刺盘孢属(Colletotrichum)菌株。对这些菌株进行形态学观察和多基因(ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH及ITS)系统发育分析的结果显示,它们分别归属于刺盘孢属的6个种,包括果生刺盘孢(C.fructicola)59个菌株、喀斯特刺盘孢(C.karstii)2个菌株、普洛柏刺盘孢(C.plurivorum)2个菌株、暹罗刺盘孢(C.siamense)1个菌株、无锡刺盘孢(C.wuxiense)1个菌株和李刺盘孢(C.pruni-salicinae)1个菌株,其中李刺盘孢(C.pruni-salicinae)为笔者鉴定出的1个新种。分离鉴定的6种刺盘孢的代表菌株,有伤接种结果显示它们均可使李叶片和果实致病,但其致病力明显不同,它们对桃、梨、柑橘和猕猴桃的致病也存在显著差异。【结论】引起福建李叶斑病的病原菌有果生刺盘孢、喀斯特刺盘孢、普洛柏刺盘孢、暹罗刺盘孢、无锡刺盘孢和李刺盘孢6种,其中果生刺盘孢(C.fructicola)为优势种,占刺分离获得的盘孢属(Colletotrichum)菌株的89.4%。不同刺盘孢菌的致病性存在明显差异。

冀中南地区黄冠梨黑斑病病原菌鉴定

为明确黄冠梨黑斑病的病原种类,采用组织分离法对100片病叶、20个病果进行病原菌分离纯化,基于TEF、ITS、GPD和Alta1序列构建多基因联合系统发育树,并结合形态学特征及致病性测定来确定黄冠梨黑斑病的病原种类及分类地位。试验共得到62个链格孢属菌株,选取6个代表性菌株进行分类鉴定,其中HG3-1、HG5、GL1、GG12和GL14与Alternaria alternata聚为一簇,HG2与A.tenuissima聚为一簇。分离菌株HG3-1、HG5、GL1、GG12和GL14的分生孢子链为1~10个分生孢子,有分支;HG2的分生孢子链为1~14个分生孢子,有分支。6个代表性菌株接种离体叶片和果实后均可发病。确定引起黄冠梨黑斑病的病原菌为A.alternata和A.tenuissima,首次从黄冠梨黑斑病中分离出A.tenuissima。

金线莲炭疽病病原菌的分离鉴定及其对9种杀菌剂的敏感性

为明确金线莲炭疽病的病原菌,根据科赫法氏则采用组织分离法对采集的病叶进行了病原菌分离,确定其致病性后,结合形态学特征及基于肌动蛋白基因(actin gene-ACT)、β2微管蛋白基因(β2-tubulin gene-TUB2)、几丁质合酶基因(chitin synthase A gene-CHS-I)、磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase gene-GAPDH)和核糖体内部转录间隔区(ITS)联合系统发育分析对该病原菌进行了鉴定,并测定了9种杀菌剂对该病原菌的离体抑菌活性。结果表明:分离得到的炭疽菌菌株在金线莲离体叶片上表现出的症状与田间自然发病症状相似,证明所分离的菌株为引起金线莲炭疽病的致病菌。根据病原菌的菌落、分生孢子及附着胞形态等初步判断其为长直孢炭疽菌Colletotrichum gigasporum;进一步基于ACT、CHS-I、GAPDH、ITS和TUB2联合系统发育分析的分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致,确定了引起该病害的病原菌为长直孢炭疽菌。离体抑菌活性测定结果表明,咪鲜胺、戊唑醇、肟菌酯、氯苯醚酰胺、苯醚甲环唑、丙硫菌唑、氟啶胺、甲基硫菌灵和百菌清对供试病原菌的EC50值分别为0.014 5、0.240、18.2、29.9、0.114、0.402、0.019 1、2.80和38.5μg/mL,其中咪鲜胺和氟啶胺的抑菌活性最强。

中国西南亚高山针叶林中的红疣柄牛肝菌分类修订中国西南亚高山针叶林中的红疣柄牛肝菌分类修订

分布于我国西南亚高山针叶林中的红疣柄牛肝菌(Leccinum rubrum)形态特异,具有潜在的食用价值。目前其物种界定仍不清晰,系统位置也未得到分子证据的支持。结合分子系统发育分析和形态观察,表明红疣柄牛肝菌应归属黄肉牛肝菌属。因此,笔者提出了一个物种新组合:红黄肉牛肝菌Butyriboletus rubrus。另外经形态比对研究发现,日本研究者曾经发表的Boletus kermesinus其实为红黄肉牛肝菌的一个异名。

应用多重GeXP-PCR同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的研究

拟建立一种基于GeXP多基因表达分析系统的多重PCR方法,同时检测6种鸡免疫抑制病病毒——鸡马立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亚群)、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒。多重PCR反应使用嵌合引物和通用引物组合的反应体系,经过GeXP多基因表达分析系统进行毛细管电泳,鉴别PCR产物片段;通过调整嵌合引物浓度、Mg^(2+)浓度、Taq酶浓度优化反应体系及调整退火温度和时间优化反应条件。应用建立的多重GeXP-PCR,分别单独和同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的8个目的基因,同时以其他常见禽类病毒和鸡组织器官核酸为对照,验证其特异性;检测8个目的基因不同浓度的克隆质粒,验证其敏感性;应用建立的多重PCR检测300份临床样品,并同时用荧光定量PCR和测序验证其检测结果的准确性。结果表明建立的多重GeXP-PCR方法能够分别扩增出6种病毒,8个特异性目的片段,不能扩增其他常见禽类病毒和鸡组织器官的基因;在低至100copies·20μL^(-1)的水平能同时特异性地检测出6种鸡免疫抑制病病毒核酸;检测300份临床病死鸡样品,190份样品显示为阳性,PCR和测序结果与多重GeXP-PCR结果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特异、敏感、高通量地检测6种鸡免疫抑制性病毒,可用于临床鉴别诊断和分子流行病学调查,具有很高的临床应用价值。

草莓根腐病病原真菌Ilyonectria novozelandica的鉴定

采用形态学与分子生物学技术对草莓根腐病病原菌进行鉴定。对草莓育苗圃内发病草莓根部进行组织培养、病原菌分离纯化,通过传统的形态学观察初步判断该病原菌菌株为土赤壳属病原菌。利用通用引物ITS1/ITS4初步鉴定该病原菌菌株ZJ16属于土赤壳属,但不能鉴定到种,又选择土赤壳属特异基因EF-1α和Histone H3基因引物序列进行PCR扩增分析,并将待测菌株测序结果与GenBank中相关菌株EF-1α和Histone H3序列进行同源性比较,待测菌株与Ilyonectria novozelandica(GenBank收录号:CBS 112593)的同源性均达到了100%。确定新疆地区草莓根腐病病原菌为Ilyonectria novozelandica,该菌种是1个中国新记录种。