多子小瓜虫PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷,建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法,实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物,经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析,分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性,对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增;扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中,普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL,荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出,荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明,在临床样本和养殖水环境样本检测应用中,基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性,能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高,适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。

几种理化因子对多子小瓜虫包囊孵化的影响

多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)的生活史分为滋养体、包囊体及掠食体3个阶段(倪达書等,1960)。小瓜虫病有着分布广泛、暴发性强、致死性高等特点(Matthews R A,2005;Buchmann K等,2001)。目前对多子小瓜虫的研究主要集中在致病机理和免疫预防方面。顾泽茂等(2019)发明了一种多子小瓜虫的传代培养方法,但因小瓜虫与鱼共存于水环境中.

36种天然植物提取物抗多子小瓜虫活性研究

研究36种天然提取物对多子小瓜虫的体外和体内杀虫活性。利用水提法和醇提法制备36种天然植物的提取物,构建体外和体内杀小瓜虫药效模型,研究36种天然植物提取物抗小瓜虫的活性。实验结果表明,牛蒡子、小果博落回、丁香、博落回、大黄等7种天然植物提取物可100%杀灭小瓜虫的掠食体和包囊。其中,大黄乙醇提取物杀虫效果最佳,其浓度达到10.0 mg·L^(-1)时,可100%抑制小瓜虫包囊的分裂孵化;其浓度为5.0 mg·L^(-1)时,可100%杀灭小瓜虫掠食体。浸泡使用30.0 mg·L^(-1)大黄乙醇提取物后,草鱼鱼体感染小瓜虫的数量显著减少,存活率可达65.8%,而对照组存活率仅为30.0%。大黄乙醇提取物对多子小瓜虫具有较好的杀灭作用。

丁香酚的分离及其杀多子小瓜虫活性研究

利用不同极性大小的溶剂石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇回流提取丁香制备粗提物,进行杀灭多子小瓜虫幼虫和包囊的药效活性追踪,确定丁香杀虫的活性部位为石油醚提取部分,进而利用硅胶柱层析和中压制备液相等分离技术结合活性追逐试验追踪分离丁香石油醚提取物（对多子小瓜虫幼虫和包囊的100%致死质量浓度分别为50mg/L和80mg/L）,最终分离获得一种杀虫活性物质,经质谱、核磁氢谱、核磁碳谱等多种波谱分析技术确定该活性物质为丁香酚。体外杀虫结果表明,丁香酚对多子小瓜虫具有较强的杀灭作用,其对幼虫15min、1h、2h、3h和4h的半数致死质量浓度分别为6.21（5.85~6.65）mg/L、3.50（3.24~3.84）mg/L、2.90（2.62~3.22）mg/L、2.33（2.10~2.50）mg/L和2.15（1.98~2.32）mg/L,对幼虫4h的100%杀灭的质量浓度为3.5mg/L,对包囊6h的100%杀灭质量浓度为3.5mg/L。结果表明,丁香酚是一种具有较好开发前景的杀多子小瓜虫药物。

多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因的表达动态

【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)感染过程中的免疫作用,为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后,采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化。【结果】草鱼感染多子小瓜虫后,TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势,TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达,在脾脏中则主要呈下调表达;TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同,其中,MyD88基因的表达在感染后第1~3 d均呈显著上调趋势(P<0.05,下同),而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P>0.05);IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势,但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势;IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调,但IFN的表达基本没有变化。【结论】草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应,尤其是在感染早期和中期发挥关键作用。

多子小瓜虫的形态发生及其寄生导致翘嘴鲌鳃组织病理变化

为阐明小瓜虫的形态发生及其对鳃组织的危害过程,本文开展了多子小瓜虫的光镜观察和翘嘴鲌鳃组织病理切片方面的研究。光镜形态研究发现小瓜虫运动时呈球形,直径500—800μm;前端具有耳廓状胞口和内陷的袋状胞咽;环境温度为18℃时,滋养体经1h左右发育成包囊,体表形成一层透明胶膜,并以虫体中央的分裂沟为界进行二分裂;子代虫体从8细胞期进入16细胞期时,包囊内部形成内胞膜将子代虫体等分为两个集团。组织切片结果显示虫体呈卵圆形,挤压了周围的包裹细胞,导致组织变形;鳃小片黏连,鳃丝上皮细胞受到破坏,严重区域鳃丝结构被完全破坏。本研究解析了小瓜虫的形态发生与发育过程以及对宿主危害的组织病理结构与机制,为揭示小瓜虫的侵染、发育和成熟规律奠定了理论基础,并为小瓜虫病害的有效防控提供理论资料。

水温对多子小瓜虫孵化及幼虫活力的影响

多子小瓜虫引起的白点病是严重危害淡水鱼类的重要疾病之一，该寄生虫的发育繁殖受温度影响极大，因此，温度是影响小瓜虫培养及其疾病发生的重要因素。为了阐明温度在多子小瓜虫生活史中的作用，在实验条件下，研究了水温对该寄生虫包囊形成、孵化和幼虫活力的影响。结果表明：水温在4℃左右或28—32℃，多子小瓜虫都不能孵化，但有少部分虫体以包囊形式存活下来；在9～27℃，随水温升高，包囊形成和孵化时间缩短，孵化率升高至100％，孵出的感染性幼虫活力增强，但活力维持时间缩短至4h。因此，建议在多子小瓜虫培养及人工感染试验中，维持23℃左右的水温较合适，这时感染性幼虫使用的有效时限是孵出后4h内。

青蒿末水浸提液对多子小瓜虫杀灭效果的研究

采用0.05、0.1、0.5、1.0以及5.0 g/L 5个浓度梯度的青蒿末水浸提液对多子小瓜虫成虫、幼虫及孢囊进行离体杀灭试验。结果表明:0.5 g/L以上浓度的青蒿末水浸提液可完全杀灭多子小瓜虫的幼虫,0.1～1.0 g/L浓度可部分杀灭成虫,1.0 g/L浓度可部分抑制孢囊分裂,5.0 g/L浓度可完全杀灭成虫和孢囊。

四氢异喹啉衍生物的合成及体外抗多子小瓜虫活性的研究

合成四氢异喹啉衍生物并进行杀多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)药效评价。以1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉为起始原料,在2位的胺基上引入与环己甲酰氯、苯甲酰氯、噻吩甲酰氯、乙酰氯以及氯乙酰氯等不同的酰基进而合成5种四氢异喹啉衍生物(化合物1~化合物5),研究其对小瓜虫掠食体和包囊的杀虫活性,并对杀虫活性物质进行安全性评价。结果显示,5种化合物均具有一定的杀虫活性,其中,化合物1 [(1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-苯基-甲酮]的杀虫活性最强,其对多子小瓜虫掠食体4 h的100%杀灭浓度为24.0 mg/L,对包囊6 h的100%杀灭浓度为60.0 mg/L,对掠食体的半数致死浓度(LD_(50))为16.4mg/L。急性毒性实验结果显示,化合物1对翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformi)的48 h LD_(50)为234.3 mg/L,其安全浓度为64.1 mg/L。研究表明,化合物1[(1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-苯基-甲酮]是一种具有较好开发前景的杀小瓜虫药物。

N-取代四氢异喹啉衍生物的合成及杀多子小瓜虫研究

以苯乙醇为起始原料,对醇基的α位碳上的氢进行取代,反应合成3种N-取代四氢异喹啉衍生物(化合物1~3),研究其对多子小瓜虫掠食体和包囊的杀虫活性,评价杀虫活性物质的安全性。试验结果表明,合成的3种四氢异喹啉衍生物对多子小瓜虫的掠食体和包囊均具有一定的杀灭作用,其中化合物1(2-甲胺基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲腈)的杀虫活性最强,其对多子小瓜虫掠食体4h的100%灭杀质量浓度为20.0mg/L,对包囊6h的100%灭杀质量浓度为40.0mg/L,对掠食体的半数致死质量浓度为11.6mg/L。急性毒性试验结果显示,化合物1对翘嘴红鲌的48h半致死质量浓度为62.78mg/L。2-甲胺基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲腈具有较好的体外杀多子小瓜虫活性,且毒性较低,具有较好的开发潜力。

不同发育阶段多子小瓜虫对几种药物的敏感性

分别采用福尔马林(100、10mg/L)、高锰酸钾(20、2mg/L)、硫酸铜(7.0、0.7mg/L)和辣椒煎水(10、1mg/L)对患病建鲤鱼种鱼体上不同发育阶段(营养体期、胞囊期和幼虫期)的多子小瓜虫(Ichthyopthirius multifillis)进行浸洗或遍洒处理,探讨了不同发育阶段的多子小瓜虫对几种药物的敏感性。结果表明:胞囊期的小瓜虫对几种药物都不敏感;自由活动期的小瓜虫幼虫对几种药物都敏感;营养体期的小瓜虫只对福尔马林和辣椒煎水2种药物敏感,对高锰酸钾不敏感,但也未加重病鱼病情,而用硫酸铜处理不但没有起到治疗的作用,反使病鱼病情加重。几种药物的处理效果比较,福尔马林不论是浸洗还是遍洒,其处理效果都最好,其次是辣椒煎水浸洗,硫酸铜处理效果最差。多子小瓜虫的药物敏感期为幼虫期在水体中独立游泳并寻找宿主的阶段,此阶段即为治疗多子小瓜虫病的最佳时间。在防治多子小瓜虫的过程中,应在第1次用药2d后到第4天时再重复用药1次,以达到最佳防治效果。

40种中草药杀灭离体多子小瓜虫效果研究

研究了40种中草药不同浓度水提物对多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)的离体杀灭效果,结果表明:夏枯草、仙鹤草和三七等18种中草药在浓度为50g/L时才能在4h内杀灭多子小瓜虫滋养体;药物浓度为10g/L时,槐花、皂角刺和毛冬青等13种中草药可杀灭滋养体;药物浓度为1g/L时,紫荆和鹅不食草即可杀灭滋养体;药物浓度为0.1g/L时,只有生姜能杀灭多子小瓜虫滋养体。生姜水提物对滋养体和幼虫的最低致死浓度分别为100、50mg/L,半数有效浓度分别为30.3、15.7mg/L,100mg/L可完全抑制包囊孵化。由此可见生姜是一种可有效杀灭多子小瓜虫的中草药。

多子小瓜虫的繁殖、离体存活、感染及病理

多予小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)灶危害鱼类较严重的寄生虫之一。自1876年Fouquel命名后，小瓜虫的繁殖曾引起各国学者的争论。Norsheimer,Maclennqn和Hass等作了这方面的研究。中国科学院水生生物研究所倪达书等也进行过此研究。

多子小瓜虫病的研究现状与问题分析

小瓜虫病又叫白点病,是由多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifilis)寄生在鱼体引起的,多子小瓜虫分布广泛,该病感染性强,且难治愈,常常给水产养殖业和观赏鱼业造成极大的损失,因此小瓜虫病一直是全球研究的热点。目前,国内对多子小瓜虫病的研究很多,但是也存在一些问题。对小瓜虫病的病理学特征、致病机理和防治方法的研究现状作一综述,并对存在的问题提出自己的见解。

多子小瓜虫生态特性研究现状

多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifilis)是淡水寄生性原生动物,分布广泛,对寄主无严格选择性,几乎能感染所有的淡水鱼类,常常给水产养殖业和观赏鱼业造成极大的损失,因此小瓜虫病一直是全球研究的热点。目前,针对小瓜虫病的研究大多从治疗方法上入手,而忽视了对多子小瓜虫的基础研究,本文就多子小瓜虫的生态特性、病理学特征与致病机理研究进展作一综述分析,旨在为国内小瓜虫病的研究提供一些借鉴。

刺激隐核虫与多子小瓜虫免疫学特性比较研究综述

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)与多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是影响渔业生产重要寄生虫,本文主要阐述了刺激隐核虫与多子小瓜虫种内和种间的免疫学相似性和差异性,及其两种寄生虫抑动抗原的免疫学特性以及克隆表达研究。为免疫学方法预防两种寄生虫病提供理论依据。

多子小瓜虫滋养体糖蛋白残基的种类和分布研究

应用伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、大豆凝集素和荆豆凝集素Ⅰ,检测寄生于金鱼皮肤、鳃和鳍上的多子小瓜虫滋养体糖蛋白残基的种类和分布。研究结果发现,伴刀豆凝集素A和麦胚凝集素免疫阳性染色在金鱼皮肤、鳃和鳍寄生的滋养体上均有分布,麦胚凝集素免疫阳性染色强于伴刀豆凝集素A,未见有大豆凝集素和荆豆凝集素Ⅰ免疫阳性染色。鳃上寄生的滋养体伴刀豆凝集素A免疫阳性染色最强,皮肤次之,鳍最弱。鳍上寄生的滋养体麦胚凝集素免疫阳性染色最强,皮肤次之,鳃最弱。研究结果表明,滋养体有单糖D-甘露糖和D-葡萄糖,以及氨基衍生物乙酰氨基葡萄糖。寄生于鳃上的滋养体D-甘露糖和D-葡萄糖可能较多,寄生在鳍上的滋养体乙酰氨基葡萄糖可能较多。

黄鳝多子小瓜虫病急性传染与防治的研究

在水温28～30℃时,多子小瓜虫造成黄鳝的严重传染,并引起大量的死亡。用0.68mol/L的NaCl溶液或5.0～6.7mmol/L乙酸浸洗10min,效果很差,高温条件下多子小瓜虫引起急性传染病是罕见的。