多孔CPC组织工程肋骨支架制备及BMSCs在其表面增殖黏附的实验研究

目的通过形态学观察、细胞黏附和细胞增殖实验观察多孔CPC材料作为组织工程肋骨支架的可行性。方法取幼猪骨髓分离培养BMSCs并传代,另自制5mm×5mm×5mm大小的多孔CPC材料,micro-CT观察孔径、孔隙率及羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)含量,并与人正常松质骨作对比。取24孔培养板,于孔内置入多孔CPC材料1块,共15块,调整第1代BMSCs浓度为6×105个/mL,将细胞悬液150μL滴加到多孔CPC材料上,置于孵育箱中复合培养4、12、24h后,收集细胞并计数,计算细胞黏附率;行倒置相差显微镜观察、MTT法检测多孔CPC材料表面BMSCs的生长情况;扫描电镜观察接种BMSCs7d的多孔CPC材料,并与单纯多孔CPC材料和正常人松质骨对比。结果BMSCs与多孔CPC材料复合培养4、12、24h的细胞黏附率分别为28.00%±0.98%、46.70%±1.14%和48.50%±1.18%。MTT法检测细胞与材料复合培养1、2、3、4、5、6d的吸光度(A)值分别为1.103±0.214、1.557±0.322、1.920±0.178、2.564±0.226、2.951±0.415和3.831±0.328,呈明显上升趋势。倒置相差显微镜下可见细胞生长旺盛,贴壁良好,未出现毒性反应。micro-CT检查示多孔CPC材料的孔径均衡,且互相连通,HA含量为(1101.2228±0.6184)mg/ccm,孔隙率为70.26%±0.45%;人正常松质骨HA含量为(1072.5523±0.7442)mg/ccm,孔隙率为72.82%±0.51%;两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察单纯多孔CPC材料孔径与正常人松质骨孔径大小、结构相似,且互相连通;BMSCs在多孔CPC材料表面排列有序,细胞呈片状,部分呈簇状,细胞形态呈多边形,细胞间可见较多细胞间质。结论多孔CPC材料结构和成分均接近正常人松质骨,BMSCs在其表面生长良好,适合作为组织工程肋骨支架材料,但其对细胞的黏附性有待进一步改善。

不同孔径CPC材料对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:评价不同大小孔径的磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cement,CPC)材料对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖能力的影响。方法:用盐析法制备三种不同孔径的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料,利用Micro-CT测量三种材料的平均孔径、孔隙率。无菌条件下取新生大鼠BMSCs原代培养并传代;将三组材料分别放置于24孔板内,每个材料接种5×104个细胞后,37℃、饱和湿度环境下静置培养。于接种后第1、4、7、14、21天用picogreen试剂盒测定细胞增值率;并在第14天、21天戊二醛固定材料并干燥喷金,扫描电镜观察材料表面细胞生长情况。结果:micro-CT测量结果显示:三种CPC材料孔径间相互连通,孔隙率均大于68%,平均孔径分别为235μm、422μm、505μm。细胞在三组材料上均呈对数增长趋势,在第14天到达平台期,在第1天三组细胞数量无明显差异,第4天450-600μm组细胞数量明显高于其余两组(P<0.05),在第7天细胞数量随孔径的增加而增加,3组间均有统计学差异(P<0.05),第14天和第21天200-300μm组细胞数量明显少于其余两组(P<0.05),300-450μm组和450-600μm组间无统计学差异(P>0.05)。结论:孔径大小可影响大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的增殖能力,随着孔径增大,细胞增殖力增高。本研究为进一步研究孔径结构对细胞的影响提供了实验依据。