三角梅品种‘绿叶樱花’4,5-多巴双加氧酶开放阅读框克隆与分析

【目的】多巴双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase extradiol)是甜菜色素生物合成途径的关键酶之一,能催化多巴分解形成甜菜醛氨酸,也是最可能与三角梅最终的花色形成相关的酶蛋白。克隆三角梅多巴双加氧酶基因的开放阅读框(ORF),对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,探讨三角梅花色变化机理和甜菜色素代谢途径。【方法】以三角梅品种‘绿叶樱花’的苞片为材料,提取其RNA,并进行逆转录,之后快速转化完成基因的克隆和基因PCR扩增,最后对其编码的氨基酸序列进行保守区预测、信号肽分析、磷酸化位点预测、跨膜信号预测、同源性比对、构建系统进化树以及二、三级结构预测,研究其氨基酸序列的结构和功能。【结果】‘绿叶樱花’的多巴双加氧酶基因ORF序列长801 bp,编码266个氨基酸。ORF序列所编码的氨基酸序列具有cd07363保守结构域,其编码蛋白是一种稳定的酸性亲水蛋白,分子量为29 734.76 kD,等电点为6.26,二级结构包含了11个α螺旋、7个β转角、20个β折叠结构,具有4个磷酸化位点,没有跨膜结构,可能只在细胞质内发挥作用。该序列还与66个序列高度同源,与同科的‘金心双色’、胶果木和梭房叶子花有着相同的进化分支,符合自然进化规律。【结论】‘绿叶樱花’多巴双加氧酶开放阅读框ORF的氨基酸序列属于第三类雌二醇双加氧基因家族,具有该基因家族具有的保守氨基酸序列,表明多巴双加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有独特的保守性,且属于稳定、酸性的亲水蛋白,没有跨膜结构,可能只在细胞质内发挥作用。三角梅中控制花色变化的主要是甜菜色素,研究三角梅甜菜色素合成途径中的关键酶,解析其甜菜色素的合成代谢机制,可为三角梅花色形成机制提供理论参考,有望在今后的工作中,利用转基因手段丰富三角梅花色。

三角梅4,5-多巴双加氧酶基因的克隆与表达分析

本研究通过同源克隆技术对三角梅(Bougainvillea glabra Choisy)甜菜色素合成途径中4,5-多巴双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase,DOD)基因进行了克隆分析。随后将获得的三角梅DOD基因克隆到表达载体pET30b(+)上,构建原核表达载体pET30b(+)-DOD,并转入大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。同时结合实时荧光定量PCR技术分析了遮光处理对三角梅DOD表达量和甜菜红素含量的影响。结果表明,三角梅DOD基因的cDNA序列长度为804 bp,编码268个氨基酸,GenBank登录号为KY676801。系统进化树分析显示该DOD与叶子花(Bougainvillea spectabilis Willd.)和紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)DOD亲缘关系比较近;原核表达得到约37 k D的目的蛋白,这与预测结果相符合;实时荧光定量PCR结果表明,遮光处理使DOD表达量降低;同时,甜菜红素含量也表现为下降。这些研究结果为解析三角梅甜菜色素合成途径提供了理论依据,为三角梅花色形成机制的研究提供了基础资料。

三色堇4,5-多巴雌二醇双加氧酶基因的克隆及生物信息学分析

本实验以三色堇(Viola wittrockiana)的花瓣为研究材料,提取其总RNA,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术扩增4,5-多巴雌二醇双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase extradiol)基因的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。本实验成功克隆VwDODA的cDNA全长1 055 bp,其中3'端非编码区157 bp,包含29 bp Poly(A),5'端非编码区103 bp,其开放阅读框为795 bp,编码263个氨基酸。通过NCBI的BLAST比对表明VwDODA编码的氨基酸序列与其他植物相关基因的相似性达到80.29%,与大豆(Glycine max)亲缘关系最近。通过生物信息学分析软件对VwDODA的蛋白质结构与功能进行预测,结果表明Vw D-%ODA是一种亲水稳定蛋白,不存在跨膜区域和信号肽,分子式为C1337H2026N356O384S7,等电点为6.70,分子量为29 455.37。本研究为将来三色堇中甜菜色素与花色素的互斥现象研究打下了基础。

叶子花花色DOD基因全长cDNA克隆与序列分析

以叶子花花苞为材料,运用RACE技术克隆出了叶子花苞片中的多巴双加氧酶基因cDNA全长,探讨叶子花花色变化机理和甜菜色素代谢途径。该序列长度为1 059 bp,开放阅读框位于56-802 bp之间,共编码249个氨基酸残基。对该氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明该氨基酸序列具有多巴双加氧酶保守结构域,所组成的蛋白分子量为27.94 kD,等电点为5.48,是稳定蛋白。对其二级结构进行预测:该序列具有8个α螺旋、8个β转角、20个β折叠,其序列大多是由亲水性氨基酸残基组成,不具有跨膜结构和信号肽。对该氨基酸序列进一步的Blast比对,发现组成多巴双加氧酶的氨基酸序列因植物种类而异,且亲缘关系越远,差异越大,结合花青素与甜菜色素代谢途径的不同和在自然界中不能共存的现象,表明多巴双加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有独特的保守性。