应用表皮分离—多巴染色法对白癜风白斑边缘黑素细胞形态学变化的研究

本文用表皮分离——多巴染色法,研究了28例白癜风患者的进行期、静止期、好转期白斑边缘表皮黑素细胞的密度和形态变化。结果表明:进行期和好转期在色素脱失区可见黑素细胞,但静止期在色素脱失区未见黑素细胞。色素区、交界区、色素脱失区表皮黑素细胞密度有显著性差异(P<0.01)。提示自癜风白斑边缘表皮黑素细胞密度和形态变化与病期有密切关系。

多巴染色与光密度法在细胞水平评价原料美白功效的应用研究

目的:在细胞水平评价化妆品原料的美白功效。方法:体外培养小鼠黑素瘤细胞B16,通过多巴特异性染色,利用平均光密度法检测化妆品原料对细胞中黑素生成的抑制作用。结果:多巴对细胞内黑素具有特异性染色,浓度为25μg/ml的曲酸对黑素细胞内黑素生成的抑制率为(48.44±3.44)%,板内标准偏差值仅为7.09%,板间标准偏差值小于7.22%,曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物均对细胞内黑素的生成具有较为明显的抑制作用,而桑白皮提取物对细胞内黑素生成几乎没有抑制作用。结论:采用多巴染色和平均光密度的方法检测黑素瘤细胞中黑素含量,精度较高、板间板内误差较小,能够成功用于化妆品原料美白功效的评测。

敲降TYRP1基因对香猪表皮黑素细胞黑色素生成的影响

旨在探究酪氨酸相关蛋白酶1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)对香猪原代表皮黑素细胞黑色素生成的影响。本研究选用具有“两头乌”毛色特征的3月龄健康香猪3头,每头猪采取头部黑色皮肤组织和背部白色皮肤组织。通过HE染色观察不同颜色香猪皮肤的毛囊结构及黑素细胞的分布特征;体外培养香猪原代表皮黑素细胞并通过多巴(L-Dopa)染色、实时荧光定量PCR和Western Blot方法进行鉴定;根据TYRP1基因序列构建5条siRNA,采用实时荧光定量PCR筛选出干扰效率最高的siRNA进行转染。成功干扰黑素细胞内TYRP1的表达后,分别通过实时荧光定量PCR、Western Blot、黑色素含量检测方法对黑素细胞内TYR、TYRP1及TYRP2的mRNA与蛋白相对表达量、细胞内总黑色素含量进行检测。结果显示,在香猪黑色和白色皮肤中都观察到完整的毛囊结构,黑素细胞主要分布在香猪黑色被毛皮肤中的毛囊外根鞘部位以及表皮。在MelM培养基作用下,黑素细胞生长旺盛,细胞形态、生长曲线、多巴染色、实时荧光定量PCR及Western Blot结果均表明培养的黑素细胞维持正常的生物学特性。敲降TYRP1后下调香猪表皮黑素细胞中黑色素生成相关基因TYR、TYRP1和TYRP2的mRNA和蛋白的表达,同时对黑色素的形成具有抑制作用。TYRP1基因能够影响香猪表皮黑素细胞黑色素的生成,研究结果可为探索TYRP1基因对香猪黑色素沉积的分子机制提供试验参考和基础数据。

水貂被毛黑色素含量及皮肤成熟黑色素细胞组织学分析

旨在分析水貂被毛黑色素含量差异及观察皮肤成熟黑色素细胞的分布特征,为水貂毛色形成调控机理研究提供理论依据。以乌贼黑为标准品,利用酶标仪测定并比较金州黑水貂、银蓝水貂和吉林白水貂被毛总黑色素(Total melanin,TM)、真黑色素(Eumelanin,EM)及褐黑色素(Pheomelanin,PM)含量;通过甲苯胺蓝、多巴及多巴联合甲苯胺蓝分别对不同毛色水貂皮肤组织进行染色。结果表明,金州黑水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分别是换毛期的1.17和1.20倍(P<0.01),EM含量显著高于换毛期(P<0.05);银蓝水貂换毛期与毛皮成熟期被毛3种黑色素含量差异不显著(P>0.05);吉林白水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分别是换毛期的1.27和1.22倍(P<0.05)。组织学染色显示,金州黑和银蓝水貂皮肤中均存在成熟黑色素细胞,主要分布于金州黑水貂的表皮和毛囊顶端,毛囊外根鞘和毛纤维髓质层有少量多巴阳性着色带;银蓝水貂皮肤的表皮和毛囊顶端多巴阳性着色带较少,毛囊外根鞘阳性着色较浅;吉林白水貂皮肤组织未见明显多巴阳性着色区域。综上表明,PM含量可能与水貂灰色和白色被毛表型相关,毛囊顶端的成熟黑色素细胞可能是水貂被毛色素沉积的主要细胞。

赤狐皮肤黑色素细胞的分离与体外培养

【目的】建立一种适合赤狐皮肤黑色素细胞的分离和体外培养体系,为研究毛色形成的分子机理提供必要载体。【方法】采集赤狐的皮肤样品,经DispaseⅡ和胰酶两步消化,以添加有表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、十四烷酰佛波醇乙酸酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol 13-acetate,TPA)和牛垂体提取物(Bovine pituitary extract,BPE)的K-SFM培养基进行原代和传代培养,再通过形态观察、用酶标仪测定黑色素含量、多巴染色结合透射电镜观察、毛色基因RT-PCR检测等方法对体外培养获得的黑色素细胞进行鉴定。【结果】体外培养获得的赤狐皮肤黑色素细胞有2或3个树突,胞质内含有大量的黑色素小体,经测定第3、4和5代细胞的黑色素含量分别为0.0283、0.0276和0.0265 ng/cell,黑色素含量差异不显著(P>0.05)。从第4代赤狐皮肤黑色素细胞的总RNA中能RT-PCR扩增出MITF、TYR、TYRP1、MITF等毛色基因特异条带,说明培养获得的赤狐皮肤黑色素细胞生物学状态良好。【结论】以K-SFM为基础培养基,通过添加EGF、TPA和BPE等成分,可体外培养获得赤狐皮肤黑色素细胞,且能有效回避添加CT培养细胞的潜在致癌风险。

兔视网膜色素上皮细胞培养和鉴定

目的:进行兔视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的体外培养,探讨RPE培养与鉴定方法,为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。方法:用改良的眼杯固定法,将其固定在眼球托上,用胰酶直接消化视网膜色素上皮面,收取RPE细胞。作细胞形态学、免疫组织化学、免疫荧光鉴定。结果:RPE细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒,多巴氧化酶呈阳性反应.免疫组织化学染色和免疫荧光染色提示角蛋白表达强阳性。结论:培养的大量细胞可用于RPE的体外实验研究,多巴染色是鉴定RPE细胞一种较好的方法。

酪氨酸酶活性的微量分析

本文介绍了两种灵敏、精确和较简便的酪氨酸酶活性的微量分析技术。其中之一是[~3H]-酪氨酸分析,直接测羟基化的酪氨酸量。根据测得的“总dpm”、“酶样品dpm”和“空白dpm”计算出微量样品中酪氨酸酶的活性。另一种方法是将各个含酶样品通过SDS-PAGE分离和适当处理,放入含多巴的磷酸缓冲液中染色,待深棕色的酶带完全显现后,再经过固定等,直接将凝胶进行光密度扫描,根据各酶带吸收峰的高度即可测出酶活性的相对变化。

化妆品原料美白功效动物评价应用研究

目的:在动物水平评价化妆品原料的美白功效。方法:以花色豚鼠为实验动物,UVB紫外照射造模后在褪毛皮肤部位涂抹样品,连续给药30天后,取皮肤组织,固定、石蜡切片,采用多巴染色或氨银染色后,对其进行光密度分析。结果:豚鼠棕色和黑色皮肤在经过UVB紫外照射后,黑素显著增大,采用棕色皮肤比黑色皮肤能够更为显著地评价曲酸抑制黑素生成的效果,具有较高的灵敏度,采用该方法发现,白藜芦醇能够有效抑制皮肤内黑素的生成。结论:采用多巴染色或氨银染色和平均光密度相结合的方法检测豚鼠皮肤中黑素含量变化,精度较高、误差较小,能够成功用于化妆品原料美白功效的评测。

水貂皮肤黑色素细胞体外分离、培养及初步鉴定

为了探究黑色素细胞在水貂毛色形成过程中的生物学功能,为毛色基因功能的深入研究提供适宜的细胞模型。本研究采用0.25%DispaseⅡ、0.1%胶原酶Ⅰ及0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)联合消化法获取水貂皮肤黑色素细胞,利用不同培养基进行选择培养、传代培养与纯化,并采用多巴染色法染色,进一步对其开展了形态学初步鉴定。结果表明,酶消化分离的水貂黑色素细胞在M-254培养基中生长良好,显微镜观察细胞呈两极或三极状,多巴染色鉴定黑色素细胞呈棕黑色阳性,初步鉴定为水貂黑色素细胞。本研究为深入揭示水貂皮肤黑色素细胞在毛色形成过程中的作用奠定了理论基础。

不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的组织学分析

羊驼是已知家养动物中天然被毛颜色最为丰富的动物之一,本研究旨在在组织水平上观察不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的分布与定位,以揭示羊驼丰富被毛颜色发生的细胞学机制。试验选择白色被毛和有色被毛成年羊驼各1头,盛毛期体侧取样,制备石蜡切片,分别采用多巴染色、甲苯胺蓝染色及多巴—甲苯胺蓝复染,光镜观察、拍照。结果表明,在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中均有成熟黑色素细胞的分布,但是分布规律不同,在有色被毛皮肤组织主要分布于毛根成形部,在毛根永久部及表皮也有分布,但是数量较少;白色被毛组织主要分布于表皮,在毛根成形部分布很少,而在真皮部及毛根永久部有少量分布。结果提示:1)羊驼不同被毛颜色发生取决于毛根成形部成熟黑色素细胞的数量;2)从一个侧面佐证了毛囊黑色素细胞与皮肤黑色素细胞在执行功能以及它们所接受的调节信号是不同的。

一种水解贝壳硬蛋白的美白作用研究

通过体外生物技术的细胞平台,从多角度对一种水解贝壳硬蛋白进行美白方面的作用研究。结果显示水解贝壳硬蛋白Ligfactor^(TM)可以明显抑制B16小鼠黑色素瘤细胞及人原代黑素细胞的酪氨酸酶活性;在人内皮素-I刺激下,其可以显著降低人原代黑素细胞的酪氨酸活性上升的情况;同时共培养显示其可以有效抑制内皮素-1刺激下黑素细胞树突结构增多的情况;多巴染色显示加入Ligfacor^(TM)黑色素染色浅,黑素含量低,说明其具有降低黑色素合成的作用。以上结果表明,水解贝壳硬蛋白Ligfactor^(TM)有美白的功效,具有应用于美白类相关产品的潜力。