过表达多巴胺脱羧酶、酪氨酸羟化酶和三磷酸鸟苷环化水解酶1重组慢病毒构建及其在帕金森病大鼠模型治疗作用的研究

目的构建同时表达3种多巴胺(DA)合成相关酶的重组慢病毒(rLV),验证其在6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病(PD)大鼠模型中治疗作用,为PD临床基因治疗提供实验基础。方法构建过表达多巴胺脱羧酶(DDC)、酪氨酸羟化酶(TH)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)rLV及对照rLV。6-OHDA制备的PD模型大鼠,随机分为生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果 PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);阳性病毒组呈现显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组比较,显著增高(P<0.01)。结论成功构建过表达DDC+TH+GCH1-rLV,并且在PD模型大鼠中呈现显著的行为改善及DA水平增加,为PD的基因治疗提供实验基础。

1个芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症家系的遗传学诊断

目的对1个芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(AADCD)家系进行基因诊断,为该家系临床治疗及产前诊断提供理论依据。方法采集患儿及其家系成员外周血行淋巴细胞染色体G显带分析,提取基因组DNA,运用单核苷酸多态性微阵列技术(SNP-array)进行全基因组拷贝数变异分析,通过全外显子组测序(WES)分析技术对先证者进行致病基因突变分析,并用Sanger测序对患儿及其家系成员样本的突变位点进行验证。结果染色体核型分析及SNP-array均未发现异常;WES结果提示先证者的DDC基因存在IVS 6+4A>T纯合突变,Sanger测序结果显示先证者胞兄存在相同的纯合突变,其父母均为DDC基因IVS 6+4A>T杂合突变携带者。结论在1个AADCD家系中发现了1个DDC基因突变,即IVS 6+4A>T,这为该家系成员提供了明确的分子遗传学诊断,为临床治疗和下次生育策略提供依据。

稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定

创建能稳定合成多巴胺(dopamine,DA)递质的三转基因(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)的骨髓间充质干细胞系(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),移植至帕金森大鼠模型脑内,为帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的临床治疗提供实验依据。通过三转基因的重组慢病毒创建能稳定合成并分泌DA递质的DA-BMSCs稳定转染细胞系,利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)、免疫荧光等技术检测BMSCs中三转基因(TH/DDC/GCH1)的表达,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测DA的合成情况。染色体G-带法检测DA-BMSCs的遗传稳定性。将DA-BMSCs移植于6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)偏侧损毁帕金森大鼠模型右脑的前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)区,检测其在PD大鼠脑内微环境中的存活、分化情况。阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导旋转实验检测DA-BMSCs移植后PD大鼠的运动障碍改善情况。DA-BMSCs细胞系中TH/DDC/GCH1三转基因均能够稳定高效表达,而正常BMSCs对照组中均不表达。三转基因感染组(DA-BMSCs)和LV-TH感染组细胞培养上清液中DA浓度极其显著高于BMSCs空白对照组(P<0.0001)。传代后的DA-BMSCs仍能稳定合成DA,并保持正常二倍体核型(94.5%)。DA-BMSCs移植PD大鼠脑内4周后,显著改善PD大鼠模型的运动障碍,在脑内微环境中大量存活,分化为TH+和GFAP+细胞,并显著上调脑移植区域的DA水平。本研究成功创建了能稳定分泌DA,在大鼠脑中大量存活并分化的三转基因DA-BMSCs细胞系,为DA-BMSCs工程化培养与移植治疗PD奠定基础。

进展期胃癌行腹腔镜胃癌根治术对腹腔冲洗液 CEA、DDC浓度和炎性因子的影响

目的:探究腹腔镜根治术治疗进展期胃癌的效果及对腹腔冲洗液癌胚抗原(CEA)、多巴胺脱羧酶(DDC)及炎性因子的影响。方法:选取2015年2月-2018年2月本院收治的进展期胃癌患者185例,按随机数表法分为研究组(腹腔镜根治术,96例)、对照组(开腹根治术,89例)。观察两组治疗情况及效果、肿瘤微转移指标(腹腔冲洗液CEA、DDC)、炎性因子[C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)]水平。结果:两组手术时间、淋巴结清扫数差异无统计学意义(P>0.05);研究组术中出血量、术后胃肠功能恢复时间、肛门排气时间、住院时间均少于对照组(P<0.05)。手术开始两组腹腔冲洗液CEA、DDC水平差异无统计学意义(P>0.05);手术结束研究组腹腔冲洗液CEA、DDC均低于对照组(P<0.05)。术前两组炎性因子水平差异无统计学意义(P>0.05);术后7d研究组的CRP、IL-6水平低于对照组,IL-10水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腹腔镜根治术治疗进展期胃癌效果确切,可相对降低肿瘤微转移风险,减轻炎性反应,促进胃肠功能及术后恢复。

胃癌开腹手术与腹腔镜手术的腹腔灌洗结果分析

目的:分析胃癌开腹手术与腹腔镜手术的腹腔灌洗结果。方法:选取胃癌患者84例,随机分为对照组和研究组,每组42例。对照组行开腹手术,研究组行腹腔镜手术。比较两组患者围术期指标(切口长度、手术用时、淋巴结清扫数量、术中失血量、术后住院时间)、腹腔冲洗液细胞学(PLC)、术后并发症发生情况。结果:研究组切口长度、术后住院时间短于对照组(P<0.05),术中失血量低于对照组(P<0.05);两组患者手术用时、淋巴结清扫数量、术后并发症发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组患者术后PLC阳性率均高于术前(P<0.05),但研究组低于对照组(P<0.05)。结论:腹腔镜手术治疗胃癌效果、安全性与开腹手术相当,但前者创伤更小、恢复更快且术后发生微转移率更低。