苇状羊茅与多年生黑麦草内生真菌菌丝基因组DNA提取的优化及PCR初步检测

感染内生真菌的禾草在牧草和草坪业上具有重要的生态和经济意义，家畜采食感染Neotyphodium coenophialum和N．lolii的苇状羊茅Festuca arundinacea和多年生黑麦草Lolium perenne会发生中毒。研究收集天津口岸1998年以来进境的部分苇状羊茅和多年生黑麦草种子，对经镜检确认带有内生真菌的种子进行分离培养，对疑似菌株的茵丝用改进的Moiler等方法进行基因组DNA抽提，测定浓度及纯度，对照原方法，DNA的纯度有较大提高，浓度略有上升。Tubulin2基因的引物IS1～IS3扩增结果显示为单一的条带，结合形态学和序列比对，分离培养得到的茵株可以基本确定为N．coenophialum和N．lolii。根据Genbank中N．coenophialum和N．lolii的NC25基因序列设计出引物F1～R1，扩增得到能区分开N．coenophialum和N．lolii的单一条带（相差160bp），建立了N．coenophialum和N．lolii的PCR检测方法，结果准确可靠。

苇状羊茅与多年生黑麦草内生真菌菌丝基因组DNA提取的优化及PCR初步检测

感染内生真菌的禾草在牧草和草坪业上具有重要的生态和经济意义，家畜采食感染Neotyphodium coenophialum和N.lolii的苇状羊茅和多年生黑麦草会发生中毒。本研究收集天津口岸1998年以来进境的部分苇状羊茅和多年生黑麦草种子，对经镜检确认带有内生真菌的种子进行分离培养，对疑似菌株的菌丝用改进的Moiler等方法进行基因组DNA抽提，测定浓度及纯度，对照原方法，DNA的纯度有较大提高，浓度略有上升。Tubulin2基因的引物IS1-IS3扩增结果显示为单一的条带，结合形态学和序列比对，分离培养得到的菌株可以基本确定为N．coenophialum和N。lolii。根据Genbank中N.coenophialum和N.lolii的NC25基因序列设计出引物F1-R1，扩增得到能区分开N.coenophialum和N．lolii的单一条带（相差160bp），建立了N．coenophialum和N．lolii的PCR检测方法，结果准确可靠。

苇状羊茅内生真菌与多年生黑麦草内生真菌实时荧光PCR检测研究

苇状羊茅内生真菌Neotyphodium coenophialum和多年生黑麦草内生真菌N．lolii对美国、新西兰等国家的畜牧业曾经造成过巨大损失。以N．coenophialum和N．lolii及其近似种N．huerfanum、N．chisosum、N．aotearoae、N．sp．共6种18个菌株,以及苇状羊茅和多年生黑麦草8个品种种子为供试材料,根据Tub-2基因设计了通用Taqman探针及引物,根据NC25基因设计了N．coenophialum和N．lolii的特异Taqman探针及共用引物,通过通用探针的单色荧光PCR和特异探针的双色荧光PCR,建立了N．coenophialum和N．lolii的菌丝及单粒种子稳定可靠、特异性强的荧光PCR检测方法,检测灵敏度达到单粒种子,使检测时间由至少一个月缩短至7～8个小时。

高羊茅和多年生黑麦草内生真菌的分子检测

根据GenBank上报道的内生真菌Neotyphodium coenophialum和N.lolii的Nc25基因序列,设计了2对特异性引物FM1/R1和F3/R652,建立了一套适合于从高羊茅和多年生黑麦草种子中检测内生真菌N.coenophialum和N.lolii的常规PCR和巢式PCR方法。

苇状羊茅及多年生黑麦草内生真菌的研究进展

本文介绍了重要禾本科牧草苇状羊茅及多年生黑麦草内生真菌对家畜的影响、对寄主本身的影响及内生真菌的传播、控制、鉴定和运用。苇状羊茅与多年生黑麦草内生真菌同属枝顶孢霉属(Acremonium),极为相似。苇状羊茅内生真菌导致牛的苇状羊茅中霉症。多年生黑麦草内生真菌造成羊及其它家畜的黑麦草蹒跚病。内生真菌可促进寄主的生长、延长寄主的寿命、抵抗病虫的侵害。内生真菌通过种子传递给牧草后代,牧草生产中用种子贮藏、种子高温处理、种子或植株药物处理控制内生真菌,防止牛的苇状羊茅中毒症和羊的黑麦草蹒跚病。草坪生产中通过接种内生真菌增加草坪草的抗虫、抗病能力,并延长其寿命。

氧化石墨烯对黑麦草种子内生真菌群落结构和多样性的影响

为了探究氧化石墨烯(GO)对黑麦草种子内生真菌群落结构和多样性的影响,将黑麦草种子在0.4%、0.8%和1.2%水平的GO溶液中胁迫4 d,采用高通量测序技术,分析GO胁迫下黑麦草种子内生真菌群落组成和多样性的变化。结果显示,4个样本所有样品共分离获得303种真菌,归属于10门39纲84目160科240属。在门分类水平上,子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)是主要的内生真菌类群;在属分类水平上,各处理的共有优势菌属为链格孢属(Alternaria)。不同GO处理黑麦草种子内生真菌群落结构存在差异,随着GO浓度的增加,子囊菌门的丰度出现下降,0.8%和1.2%GO处理较对照分别显著降低了19%和20%(P<0.05);所有GO处理的担子菌门丰度均显著高于对照(P<0.05);1.2%处理链格孢属的丰度较对照显著降低了37.36%。与对照相比,1.2%GO处理内生真菌的丰富度和多样性显著增加,ACE、Chao1和Shannon指数分别增加了123.5%、127.4%和117.5%(P<0.05)。主坐标分析(PCoA)分析表明,1.2%GO处理内生真菌群落结构与其他处理有较大差异;线性判别分析(LEfSe)分析发现,各处理差异指示种明显不同。可见,GO改变了黑麦草种子内生真菌群落的组成和多样性,尤其是高浓度处理(1.2%)。研究可为碳纳米材料暴露对共生物种的潜在影响研究提供参考。

不同磷水平下幼套球囊霉与禾草内生真菌对多年生黑麦草生长的影响

通过盆栽试验探究了4个磷(P)水平(0、10mg·kg^(-1)、20mg·kg^(-1)、30mg·kg^(-1))下,丛枝菌根真菌(arbus-cular mycorrhizal fungus,AMF)幼套球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)与禾草内生真菌(Epichloё)对多年生黑麦草(Lolium perenne)生长、养分吸收、光合特性和磷酸酶活性的影响。供试多年生黑麦草植株分别由含有禾草内生真菌(E^+)和不含禾草内生真菌(E^-)的种子建植获得。结果表明:AMF对植物生长的促生效应可通过适量P添加得到加强;内生真菌增加了黑麦草的生物量和养分含量,并与AMF间存在交互效应,抑制其侵染,侵染率降低15.85%～20.03%;二者共同作用(AMF^+E^+)的地上生物量较AMF^-E^+降低1.45%～17.74%,P0和P10(10mg·kg^(-1))水平下高于AMF^+E^-处理,P20(20mg·kg^(-1))和P30(30mg·kg^(-1))相反。对全P含量的影响与对生物量的影响趋势基本一致。AMF+E+处理的净光合速率、蒸腾速率和气孔导度高于或介于AMF^-E^+和AMF^+E^-之间,磷酸酶活性低于或介于AMF^-E^+和AMF^+E^-之间。说明较适P水平加强了微生物效应,利于植物生长。

干旱条件下内生真菌对多年生黑麦草生长的影响

本研究分别比较了在温室不同水分处理条件和田间自然条件下,包括100%被内生真菌感染(E+)种群,未被内生真菌感染(E-)种群和50%带菌率的E+和E-植株混合种群(M)的3种不同多年生黑麦草(Lolium perenne)种群的生长情况,以分析内生真菌对其寄主多年生黑麦草生长的影响。在模拟田间最大持水量(Field Water Content,FWC)的15%(FWC_(15))、30%(FWC_(30))、45%(FWC_(45))和60%(FWC_(60))的4种不同水分处理的温室盆栽试验中,随着土壤水分含量的增大,E+、E-和M种群的株高、分蘖数、株高生长速率、分蘖生长速率、叶宽、叶长、地上组织含水量和地上生物量先逐渐增大,在FWC_(45)水分条件下达到了最大,然后在FWC_(60)水分条件下各项生长指标降低,均低于FWC_(45)水分处理,说明FWC_(45)水分条件最适宜黑麦草幼苗的生长,而FWC_(15)、FWC_(30)和FWC_(60)水分条件对黑麦草幼苗的生长具有抑制作用;在盆栽各水分条件下,E+种群的分蘖数、株高生长速率、分蘖生长速率、叶宽、地上部组织含水量均显著高于E-和M种群(P<0.05);E+种群的叶长显著大于E-种群(P<0.05);在FWC_(60)水分条件下,E+和M种群的地上部生物量差异不显著(P>0.05),但均显著高于E-种群(P<0.05),而在其余3个水分条件下,E+种群均显著大于E-和M种群(P<0.05),但是E-和M种群之间无差异。在田间自然条件下,E+种群的株高、分蘖数、株高生长速率、分蘖生长速率、叶宽、地上部生物量均显著高于E-和M种群(P<0.05);而E+种群的叶长和地上部组织含水量与M种群差异不显著(P>0.05),但显著高于E-种群(P<0.05)。这说明内生真菌在温室和田间均能促进多年生黑麦草的生长,并增强其抗旱性和对该地区的环境适应性,内生真菌带菌率越高,其优势越明显。

磷添加条件下摩西球囊霉与禾草内生真菌对多年生黑麦草生长的影响

本试验探究了不添加磷(P_0)和添加50 mg/kg(P_(50))条件下,丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae,AM)真菌摩西球囊霉(Glomus mosseae)和禾草内生真菌对多年生黑麦草生长、养分吸收和磷酸酶活性的影响。多年生黑麦草分别由含有禾草内生真菌(E+)和不含禾草内生真菌(E-)种子建植获得。结果表明:1)AM真菌与禾草内生真菌可显著影响多年生黑麦草的生物量(P<0.05),二者共同作用(AME+)时生物量最低。P0处理,以AM真菌E-植株生物量最高。P50条件下,对照(NME-)最高;2)P添加平均提高AM真菌的侵染率11.40%,P0和P50条件下E+植株较E-植株的菌根侵染率分别低18.65%和11.77%;3)AM真菌未显著影响P吸收(P<0.05)。禾草内生真菌增加了植株N含量,而AM真菌侵染降低了E+植株N含量;4)P添加显著提高了磷酸酶活性(P<0.05),不同处理以AME+的磷酸酶活性最高。两种共生微生物在不同P条件下,单独作用均有利于植物生长,共同作用时因对光合产物存在竞争,并未协同促进植物生长和养分吸收。

进境苇状羊茅和多年生黑麦草种子携带内生真菌带菌率的研究

苇状羊茅内生真菌和多年生黑麦草内生真菌曾给一些国家的畜牧业造成巨大损失。为防止内生真菌随进境草籽传入我国并在中国扩散危害,我们对该2种进境草籽内生真菌的带菌率进行了研究。首先通过分离培养,得到了苇状羊茅内生真菌和黑麦草内生真菌,然后采用染色法对1998年以来收集到的从天津口岸进境的部分苇状羊茅和黑麦草种子进行了初步检验,经检验,37份苇状羊茅样品中有18个品种带菌,34份多年生黑麦草样品中14个品种带菌,带菌率最高可达86.7%。早熟禾、剪股颖等其它禾本科草籽目前尚未发现带有内生真菌。

内生真菌对苇状羊茅和多年生黑麦草影响的研究进展

综述了内生真菌的分类及其在宿主苇状羊茅Festucaarundinacea和多年生黑麦草Lolium perenne中的分布与传播方式 ,阐述了内生真菌对苇状羊茅和多年生黑麦草生长、抗生物 (病虫害 )和非生物胁迫 (P胁迫和干旱胁迫等 )、以及对其他草类的竞争他感作用的影响 ,并提出今后的研究方向。

丛枝菌根真菌与褪黑素对多年生黑麦草耐热性的影响

高温胁迫是限制冷季型草生长发育的主要因素。为探究单独接种丛枝菌根真菌(AMF)和外源褪黑素以及联合应用对多年生黑麦草生长和耐热性的影响,采用盆栽试验测试分析高温胁迫下丛枝菌根真菌和外源褪黑素处理对多年生黑麦草的生长,内源褪黑素含量及其合成基因的表达,抗氧化能力和渗透调节物质含量的影响。结果表明,高温胁迫明显抑制多年生黑麦草的生长,而外源褪黑素处理提高了AMF在多年生黑麦草根系中的定殖率。接种AMF和/或褪黑素处理均能促进高温胁迫下多年生黑麦草的生长,增加多年生黑麦草根系内源褪黑素含量和上调褪黑素合成基因的表达,降低相对电导率(EL)、丙二醛(MDA)含量和多酚氧化酶(PPO)活性,同时提高根系抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,以及类黄酮、脯氨酸、总酚、可溶性糖和甜菜碱的含量。其中接种AMF和褪黑素联合应用对提高多年生黑麦草耐热性效果最佳。总的来说,AMF接种和褪黑素处理可上调多年生黑麦草根系褪黑素合成基因表达,提高内源褪黑素含量,增强抗氧化酶活性,降低氧化损伤,同时提高渗透调节能力以增强多年生黑麦草的耐热性。

磷、AM真菌与禾草内生真菌对多年生黑麦草离蠕孢叶斑病的影响

本研究在温室设置不添加磷(P_0)和添加20 mg/kg磷(P_(20))处理,探究丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae,AM)真菌幼套球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)与禾草内生真菌(Epichloё)对多年生黑麦草(Lolium perenne)离蠕孢叶斑病(Bipolaris zeae)的影响,以期通过P调节,实现共生微生物的高效利用。多年生黑麦草分别由含有禾草内生真菌(E^+)和不含禾草内生真菌(E^-)的种子建植。主要结果如下:(1)P显著增加了多年生黑麦草的生物量、N、P含量以及AM真菌侵染率(P<0.05),但未影响植物发病率。(2)P_0处理下,AM真菌降低了植物生物量和N、P含量,禾草内生真菌反之;P_(20)水平,AM、禾草内生真菌未显著影响植物生长和养分含量(P>0.05)。(3)两个P水平下,接种AM真菌处理(AME^-)的发病率最高,含禾草内生真菌的E^+植株最低。(4)AM真菌与禾草内生真菌单独作用或互作的抗病相关酶活性高于对照。

不同盐浓度下AM真菌和禾草内生真菌对多年生黑麦草生长的影响

以多年生黑麦草(Lolium perenne)为材料,在温室内研究了不同盐浓度处理下丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌和禾草内生真菌(grass endophyte)对黑麦草生长的影响。试验设对照,无盐胁迫(0%)、轻度盐胁迫(0.2%NaCl)和重度盐胁迫(0.5%NaCl)处理,AM真菌为摩西球囊霉(Glomus mosseae),禾草内生真菌处理以含有、不含有内生真菌种子建立。结果表明:盐分处理可显著降低黑麦草的株高、生物量、根冠比,以及AM真菌的菌根侵染率,禾草内生真菌与AM真菌均在不同盐分处理下对黑麦草的生长有一定的促进作用,两菌协同作用明显,其中禾草内生真菌处理下的多年生黑麦草的株高、地下生物量和根冠比较对照分别增加13.26%,15.30%和19.51%(P<0.05);AM真菌处理下黑麦草的株高、N、P含量分别提高9.76%,32.12%和12.45%(P<0.05);在无盐胁迫下,禾草内生真菌可促进丛枝菌根真菌侵染,使其侵染率提高5.53%。与两类共生微生物单独作用相比,AM真菌与禾草内生真菌互作,对多年生黑麦草生长、耐盐性有一定的提高,但差异不显著。

不同生长条件下内生真菌对多年生黑麦草生理特性的影响

本研究通过比较带内生真菌(E+)、不带内生真菌(E-)和混合(M)3个种群的多年生黑麦草(Lolium perenne)在田间自然条件和温室不同水分处理下生理指标的变化,以解释内生真菌在不同生长条件下对多年生黑麦草内部生理机制的影响。结果表明,在温室条件下,土壤含水量为田间最大持水量(field water content,FWC)的15%(干旱)和60%(水淹)时,内生真菌侵染显著(P<0.05)提高了多年生黑麦草总叶绿素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性,同时降低了丙二醛含量和过氧化物酶活性,但在水分含量为45%FWC时,3个种群生理指标并无显著差异(P>0.05);说明在胁迫条件下,内生真菌通过提高保护酶活性以增加寄主的抗逆性。在田间条件下,黑麦草叶绿素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性的变化趋势依次为E+>M>E-,丙二醛含量和过氧化物酶活性的变化趋势依次为E->M>E+,表明在自然生长条件下,内生真菌仍然通过内部生理机制的改变促进寄主生长。

中华羊茅内生真菌共生体对多年生黑麦草种子萌发和幼苗生长的影响

以青海和四川6个不同地理种群内生真菌侵染(E+)和未侵染的(E-)中华羊茅(Festuca sinensis)为材料,研究其对多年生黑麦草(Lolium perenne)品种维纳斯(Venus)和绅士(Esquire)种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明:与对照相比, Venusl发芽率、发芽势、发芽指数、种子活力指数、胚根长在种群99、141草粉处理下均显著下降(P<0.05), Esquire发芽势、发芽指数、种子活力指数在种群41和99草粉处理下均显著下降(P<0.05);同一地理种群84草粉处理Esquire,E+的发芽势和发芽指数显著低于E-(P<0.05),种群41草粉处理E+的总生物量显著低于E-(P<0.05);在相同处理下, Venusl品种的发芽率、发芽势、发芽指数、种子活力指数和胚芽长显著低于Esquire品种的发芽率、发芽势、发芽指数、种子活力指数和胚芽长,说明内生真菌能够影响黑麦草的萌发,且不同地理种群对其种子萌发作用不同,中华羊茅草粉对Venus的抑制作用更强,E+草粉的抑制作用强于E-。

干旱胁迫下水杨酸和内生真菌对多年生黑麦草的影响

本试验研究了温室盆栽条件下带内生真菌(E+)和不带内生真菌(E-)的多年生黑麦草喷施不同浓度水杨酸(SA)后,持续干旱胁迫15 d和对照水分两种条件下,多年生黑麦草的叶片相对含水量(RLWC)、叶绿素含量(Chl)、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)和可溶性糖(SS)含量等生理指标的变化,以明确干旱胁迫下SA和内生真菌对多年生黑麦草的影响。结果表明,在干旱胁迫下,感染内生真菌的多年生黑麦草叶片相对含水量、叶绿素含量、POD活性、SS含量显著(P<0.05)高于未感染内生真菌的多年生黑麦草植株;一定浓度的SA增加了多年生黑麦草叶片相对含水量、叶绿素含量、POD活性、SOD活性、Pro和SS含量,降低了MDA含量,且最适水杨酸浓度为0.25和0.50 mmol·L-1;内生真菌与SA互作显著(P<0.05)提高了多年生黑麦草SOD活性、POD活性和叶绿素含量。该结果说明内生真菌与SA都能提高多年生黑麦草的抗旱性,即内生真菌和SA通过提高寄主的渗透调节和活性氧清除系统进而提高了寄主的抗旱性。

水分胁迫下内生真菌感染对黑麦草叶内保护酶系统活力的影响

比较了两种不同的水分胁迫方式 (田间干旱胁迫和温室渗透胁迫 )下 ,内生真菌感染对黑麦草叶内SOD、POD和CAT活性以及MDA含量变化的影响 .结果表明 ,当植物未遭受水分胁迫时 ,感染植株叶内SOD和POD活性明显高于非感染植株 .在温室渗透胁迫下 ,随着胁迫强度和胁迫时间的增加 ,感染植株叶内SOD活性明显高于非感染植株 ,MDA含量大大低于非感染植株 ;而在田间干旱胁迫下 ,感染植株的这种优势表现得并不明显 .图 2表 2参 2

干旱胁迫下内生真菌感染对黑麦草叶内几种同工酶的影响

以内生真菌感染 (endophyte- infected,EI)与不感染 (endophyte- free,EF)的黑麦草 (L olium perenne L.)种子建立实验种群 ,分别对其施加长时间不同强度的干旱胁迫 ,通过比较黑麦草体内过氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶 (SOD)、多酚氧化酶(PPO)活性及其同工酶谱的变化以探讨保护酶系统在内生真菌——植物共生体的抗旱性方面所作的贡献。研究结果表明 ,水分胁迫和内生真菌对黑麦草 3种酶的影响不仅表现在总量上而且表现在同工酶的酶谱及各区带的酶活力上。就总酶活力而言 ,EI和 EF植株中 POD、SOD和 PPO的活性均随着干旱胁迫强度的增加而增加 ,进一步将 EI和 EF植株的酶活力进行比较 ,发现与 EF植株相比 ,EI植株中 POD和 PPO的活性相对较低 ,而 SOD的活性相对较高。从同工酶的谱带数量和强弱来看 ,POD同工酶各区带活力均随干旱胁迫强度的增加而增加 ,EI植株叶片增加的幅度高于 EF叶片 ,而且 EI叶片在重度胁迫下出现了 1条新带 ;SOD同工酶各区带活力在 EI叶片中有随干旱胁迫增加而增加的趋势 ,而在 EF叶片中有些区带酶活力增强 ,有些区带酶活力减弱 ,且 EI叶片在中度胁迫下出现了 1条新带 ;PPO同工酶随干旱胁迫的增强 ,EI和 EF叶片均表现为有些区带酶活力增强 ,有些区带酶活力减弱。总之 ,内生真菌的感?

水分胁迫下内生真菌感染对黑麦草叶内游离脯氨酸和脱落酸含量的影响

以黑麦草为实验对象 ,研究了干旱胁迫条件下内生真菌感染对植株叶片含水量和叶内游离脯氨酸含量的影响 ,同时对渗透胁迫条件下植株叶内 ABA含量的变化进行了分析。结果表明 :1内生真菌的感染有助于使叶片保持较高的含水量 ;2在两种形式的水分胁迫下 ,前期至中期高感染种群的叶片游离脯氨酸含量低于低感染种群 ,而在末期则有高出低感染种群的趋势 ;3内生真菌感染对黑麦草叶内