实时荧光等温多自配引发扩增技术检测深圳市手足口病肠道病毒71型评价

目的：应用实时荧光等温多自配引发扩增技术（荧光RT-IMSA）实现肠道病毒71型（EV71）快速检测．为手足口病的综合防治和动态监测提供手段和依据。方法：随机选取2014年1-12月深圳市哨点医院手足口病确诊患者轻症156例，重症84例，运用荧光RT-IMSA技术检测患者样本EV71，描述EV71的流行病学特征，并与qRT-PCR法比较。结果：240例手足口病确诊患者中，重症患者EV71检出率为77．3％，轻症患者25．6％（P〈O．05）。男女性EV71感染率相同（P〉0．05），年龄为0～1岁患者EV71感染率较低（P〈0．05）。荧光RT-IMSA技术与qRT-PCR法比较结果较一致，rappa值为0．87（P〈0．05）。结论：深圳市EV71在不同年龄、不同病情的手足口病患者中分布不同。荧光RT-IMSA法呈现较高的特异性和灵敏度，可用于EV71的快速检测。

等温多自配引发扩增技术快速检测学校餐饮中三种食源性致病菌

目的:本文研究了一种适合学校餐饮中快速鉴别三种食源性致病菌的检测方法。方法:基于等温多自配引发扩增技术(isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA),选择沙门氏菌的invA基因、大肠埃希氏菌O157:H7/NM的rfbE基因和单核细胞增生李斯特氏菌的prfA基因设计特异性引物,检测菌液灵敏度、特异性、最短增菌时间、最低含菌量检出限等指标;以食品安全国家标准食品微生物学检验(GB/T 4789.4-2016、GB/T 4789.30-2016、GB/T 4789.36-2016)为参考方法,比较两种方法的一致性。结果:该方法对沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7/NM和单核细胞增生李斯特氏菌的菌液灵敏度分别为2.14×10^(3)、2.79×10^(3)和3.62×10^(3)CFU/mL;特异性高达100%;人工污染最短的增菌时间分别为6、8和8 h;最低含菌量检出限分别为2.14、2.79和3.62 CFU/25 g;74例食品样本的IMSA法结果与国标法一致性达100%。结论:IMSA技术检测食源性致病菌的灵敏度高、特异性强、结果准确,可在短时间内完成食品中三种致病菌的检测,适合于学校餐饮中致病菌的快速鉴别。

交叉引物等温扩增技术检测志贺氏菌

建立一种新型志贺氏菌简洁快速检测方法——交叉引物恒温扩增检测方法。针对志贺氏菌的四个血清型设计保守的特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法并应用免疫金标试纸条进行检测。用6株志贺氏菌,32株近源菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、干扰菌试验检测进行灵敏度验证。建立方法具有较好的特异性,增菌液及干扰菌检测灵敏度均为103cfu/mL。建立的交叉引物恒温检测方法灵敏度高,可满足对志贺氏菌进行现场快速筛查目的。

交叉引物等温扩增技术检测沙门氏菌

建立一种新型沙门氏菌快速筛选检测方法--交叉引物恒温扩增检测方法。针对沙门氏菌设计特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法进行检测。用19株沙门氏菌,35株近源菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数检测进行灵敏度验证。建立方法具有很好的特异性;增菌液检测灵敏度为102cfu/mL,DNA检测灵敏度为101fg/test。建立的交叉引物恒温检测方法特异性好、灵敏度高,不需要复杂仪器,对口岸快速筛查、基层或偏远经济不发达地区顺利开展检测具有实际意义。

人乳头瘤病毒16和52型双荧光等温多自配引发扩增的检测方法

应用等温多自配引发扩增(IMSA)技术,分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物,并在检测体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂,建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法.结果表明:340μmol/L HNB与1∶10 000SYBR GreenⅠ混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果,455nm蓝光激发下阳性反应管双荧光显色为黄绿色,阴性反应管双荧光显色为橘红色;该方法对HPV16和HPV52型检测限分别达60,600拷贝/μL,可特异性检出样品中HPV16和HPV52,与临床检测结果比对无差异.

交叉引物等温扩增检测霍乱弧菌方法的建立

建立食品中全血清型霍乱弧菌的交叉引物等温扩增检测方法。针对霍乱弧菌设计特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法,利用免疫金标试纸条对结果进行检测。用57株霍乱弧菌及相近株细菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数、样品中添菌检测及与环介导等温扩增方法进行灵敏度验证及比较工作。结果表明,建立方法具有较好特异性;DNA检测灵敏度为79.28 fg/test,增菌液检测灵敏度为4.2×102CFU/m L,当每25克样品中有5.6 CFU菌时经增菌步骤后即可检出。建立的交叉引物恒温检测方法可作为食品中霍乱弧菌快速初筛检测方法使用,较环介导等温扩增方法灵敏且易于操作。

新等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌

应用新型等温扩增检测技术——交叉引物等温扩增结合免疫金标试纸条建立检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。针对小肠结肠耶尔森氏菌16-23S rDNA间区序列设计特异性引物及探针,用54株小肠结肠炎耶尔森氏菌及相近株细菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、样品中添菌检测进行灵敏度验证;对677份食品用传统生化国标法进行比较检测试验。建立方法具有较好特异性;增菌液检测灵敏度为10^1cfu/mL,当每25g样品中有10^0cfu菌时经增菌步骤后即可检出,样品检测同传统检测结果比较大致相符,没有漏检,假阳性率较低。建立的新型恒温检测方法可用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌初筛检测。

等温扩增技术在检测食品中金黄色葡萄球菌的应用

评价交叉引物恒温扩增方法对食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的检测效果。应用针对凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌建立等温扩增方法对5类15种食品进行凝固酶阳性金黄色葡萄球菌检测,根据ISO 5725-2:1994标准要求,以现行国家标准为基准方法,对交叉引物-待确认方法进行灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率及相对准确度等五方面验证。建立的交叉引物等温扩增方法灵敏度100%、特异性98.1%、假阴性率0、假阳性率1.9%、相对准确度98.3%。

交叉引物等温扩增技术在EHEC检测中的应用

目的建立一种新型的交叉引物等温扩增技术检测组织中的肠出血性大肠杆菌(EHEC),为临床诊断提供快速、灵敏、有效的检测方法。方法根据EHEC O157:H7的基因特征性保守序列,进行交叉、剥离引物设计之后,采用检测探针来进行O157:H7检测,从而检测出比较常见的食源性细菌并对这些细菌的特异性进行验证,对菌液进行不同浓度稀释,从而对交叉引物等温扩增技术检测的灵敏度进行评估,多次实验验证此方法的实用性。结果检测中,仅O157:H7菌株呈阳性,特异性良好,灵敏度也比较高。结论在EHEC O157:H7进行检测的过程中,应用交叉引物等温扩增技术来进行,操作简单易上手,检测速度比较快,检测灵敏结果准确,特异性比较强,应当广泛应用于肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测实践当中。

等温核酸扩增技术进展

等温核酸扩增技术已广泛应用于生物分析的体外核酸扩增,本文综合国内外报道,对等温核酸扩增技术的进展进行简要综述,包括依赖核酸序列型扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、单引物等温扩增(SPIA)、交叉引物等温扩增(CPA)、新型等温多自配引发扩增(IMSA)的原理、重要特性、应用及未来的展望。

交叉等温扩增技术快速检测幽门螺杆菌方法的建立

目的建立一种新型的交叉引物等温扩增技术(cross-primer amplification,CPA)检测组织中的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.Pylori),为临床诊断幽门螺杆菌感染提供快速、灵敏、有效的检测方法。方法针对幽门螺杆菌尿霉素B基因(UreB)为靶序列设计3套交叉引物等温扩增方法的特异性引物,随后对反应体系的扩增温度、Bst DNA聚合酶浓度和扩增时间进行优化;选取2株幽门螺杆菌与其他7株致病菌进行特异性和敏感性试验;以尿素呼气法(UBT)为参考标准,检验CPA法对75例临床胃黏膜组织样本中幽门螺旋菌的检测灵敏度。结果幽门螺杆菌反应最佳引物组合为HCPA-3,最优反应温度为62℃、Bst DNA聚合酶浓度为6 U、反应时间为60 min;建立的方法具有较好的特异性,且检测灵敏度为1.26×102 cfu/mL;75例临床胃黏膜组织样本进行检测结果显示,CPA方法共检测出阳性标本26例,检出率为34.57%,准确率为96.30%(26/27)。结论 CPA法是一种快速、简便且高灵敏性和特异性的诊断方法,为临床上快速诊断幽门螺杆菌奠定了基础。

等温扩增荧光技术快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

等温荧光扩增技术--Isothermal Amplification Fluorescent Method（IAFT）是核酸体外扩增和荧光法技术的结合,在恒温条件下进行,通过添加特殊的DNA聚合酶和特异性引物,在扩增的同时加入荧光基团,通过荧光信号累积实时监控扩增过程,实现核酸快速扩增和检测,并对产物做溶解曲线分析。本研究针对金黄色葡萄球菌特异性的femA基因片段设计并筛选出了IAFT法的特异性引物,验证特异性和灵敏度,并与传统检测方法做对比,结果符合率为100%。

埃博拉病毒扎伊尔亚型多引物自配引发等温扩增方法的建立

鉴于目前埃博拉疫情在西非流行和输入国内的潜在风险,开发快速准确易普及的检测埃博拉病毒的方法对埃博拉防控具有重大意义。本文拟建立一种基于颜色判定简单、快速和灵敏的方法,即多引物自配引发等温扩增技术(isothermal multiple self-matching initiated amplification,IMSA)应用于埃博拉病毒扎伊尔亚型的检测。该技术设计了分别对应于埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白(nuclear protein,NP)基因的7个区段的6条特异引物,在等温(63℃)条件下进行核酸扩增反应1小时,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色变化作为结果判定的标准。文中利用这种技术与RT-qPCR分别对含有目的片段的假病毒的系列稀释物以及模拟临床样本进行灵敏度分析,同时对30例健康人血浆以及登革病毒、日本脑炎病毒样本进行特异性分析。在塞拉利昂完成了81例埃博拉疑似病例血液样本的检测。结果显示RT-IMSA方法检测灵敏度与RT-qPCR方法的灵敏度相当,30例健康人血浆样本检测均为阴性,并且与登革病毒及日本脑炎病毒无交叉反应。与获得批准的荧光定量PCR试剂盒比较,RT-IMSA检测81例临床样本的结果为53例阳性,23例阴性,5例假阴性。灵敏度和特异性分别为91.4%和100%。因此,相较于RT-qPCR的高成本和复杂操作,RT-IMSA方法具有快速、简单的检测优势。

RPA技术在金葡菌检测中的研究进展

金黄色葡萄球菌可以在人体内外寄生或污染食物,导致皮肤溃烂、免疫力下降和食物中毒等一系列症状,对人体健康构成危害。重组酶聚合酶扩增技术具有反应温度低、反应速率快和特异性高的特点,在不需要精密仪器的情况下能够更准确、高效、快速地检测出金黄色葡萄球菌。本文主要通过综述重组酶聚合酶扩增技术在金葡菌检测中的国内外现状以及其反应机理、引物设计方法等内容,探讨了其中的意义和存在的问题,并展望了该领域未来的发展前景,旨在为公共卫生和食品安全领域提供可行的解决方案。

利用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌

目的:建立基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的霍乱弧菌快速检测方法,为霍乱疫情监测与预防提供及时的应急检测服务和参考结果。方法:通过Genbank检索、下载霍乱弧菌ctxA基因序列,使用BLAST、GENtle、DNAMan等相关核酸序列分析软件比对分析确定目标序列,使用PrimerExplorer v4软件设计霍乱弧菌LAMP引物。以SYBR Green I作为荧光剂在荧光定量PCR仪上实时检测LAMP反应结果,作为本研究的主要研究方式。通过优化反应温度、时间、组成浓度等实验条件对LAMP检测方法进行改进,并与PCR方法进行比较与评价。结果:从分属不同种属的20株实验菌株中分别正确地检出所有5株产霍乱毒素的霍乱弧菌菌株,对菌株纯培养物的检出限达到了5 cfu/μl(10 cfu/reaction)。结论:本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法是一种灵敏、特异、快速、简便的霍乱弧菌检测方法,适于基层单位推广使用,对霍乱疾病监测与暴发后疫情应急检测具有重要意义。

负压驱动皮升级等温核酸精确定量微流控芯片

精准医疗急需更加精确、灵敏、方便快捷的核酸定量方法。设计开发了一种结合双荧光等温扩增的高密度皮升级核酸定量微流控芯片。芯片采用多层软光刻技术制成,有3个反应通道,每通道有40 000个反应小室,共120 576个皮升级反应小室,反应小室的密度达7 000/cm^2。芯片利用负压驱动样品精确分配,热凝固油相封闭小室,无需阀门及其他仪器辅助。芯片中嵌入的氟硅烷纳米涂层能有效地阻止反应过程中水蒸气的散失。以乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)质粒作为模板,进行等温多底物自配引发扩增(isothermal multiple self-matchinginitiated amplification,IMSA),测试芯片定量性能。芯片检测模板的动态范围达6个数量级,可检测的最大模板量为36μL中1.13×10~6拷贝数核酸。该装置具有定量精确、灵敏、快捷、操作简单等优势,可用于精准检测。

IMSA技术快速检测肠出血大肠杆菌O157:H7方法的建立及应用

为了建立和评价一种适合食药监及基层检验部门使用的肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测方法,针对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性rfbE基因,应用等温多自配引发扩增技术(Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA),设计引物进行检测。对建立的方法进行特异性试验和灵敏度试验,与荧光定量PCR法进行比对;利用建立的IMSA法确定人工污染样本被检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;使用IMSA法和国标法对24份不同肉制品进行检验,评估两者的一致性。结果表明:该方法仅对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性扩增;IMSA法的灵敏度比qPCR法高,达8.9×10^(2) CFU/mL;人工污染菌种样本最短增菌10 h可以被建立的IMSA法检出,检出限为9.1 CFU/25 g;24份肉制品样本的IMSA法与常规培养法结果一致性为100%。结论:IMSA技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7具有特异性强、灵敏度高、结果快速准确的特点,可在11 h内完成食品中O157:H7的检出,适用于食药监及基层检验部门进行肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。

逆转录交叉引物等温扩增检测南方菜豆花叶病毒方法的建立

南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)是我国进境植物检疫性病毒,可随豆类种子远距离传播。本研究针对SBMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计特异引物组,建立了一种反转录(reverse transcription,RT)交叉引物扩增(cross-priming amplification,CPA)快速检测方法,并分别结合实时荧光和侧向层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测扩增产物构建了实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD体系。结果显示,所建立的针对SBMV的RT-CPA检测方法特异性强,以其他4种可随豆类种传的植物检疫性病毒为对照,均无交叉反应。其中,实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD检测SBMV灵敏度分别达5×10^(-4)ng/μL和5 ng/μL。所建立的RT-CPA检测SBMV方法具有快速、准确、可视化等优点,在口岸检测中具有良好的应用前景。

环介导等温技术在假结核耶尔森菌检测中的应用

目的:参照环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的基本原理、特点,并应用于假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis,Y.pseud)的检测。方法:应用LAMP技术,针对Y.pseud的inv基因设计合成6条引物(2条内引物,2条外引物及2条环引物),对12株耶尔森菌进行检测,并将其结果与传统结果相比较。结果:所检测的菌株样本中3株Y.pseud经LAMP检测均显绿色为阳性,而其余致病性和非致病性的Y.ent均显橙色为阴性。结论:LAMP方法快速、特异性强且操作简便,极适宜在基层实验室应用。

柞蚕核型多角体病毒实时荧光LAMP检测方法的初步建立

柞蚕脓病是柞蚕生产上的主要病害之一,病原为柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)。建立快速而准确检测蚕体样品中Ap NPV的技术,将有助于对病害的早期诊断及流行病学调查和实施有效的防控措施。以柞蚕核型多角体病毒ORF142基因为靶基因,设计2组特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,利用实时荧光PCR技术进行检测分析。结果表明,设计与合成的2组引物均能对柞蚕核型多角体病毒基因组扩增出特异性产物,其中引物组2在63℃开始孵育60 min,反应起始扩增时间为12 min,当反应时间达到40 min时,扩增曲线的最大相对荧光强度(RFU)值达6 000,相对于引物组1具有更好的及时性,可缩短一半反应起始时间。初步建立的Ap NPV实时荧光LAMP检测方法相对于传统PCR方法,检测效率提高4倍左右。