亚硒酸钠促进多形汉逊酵母DL-1合成谷胱甘肽的转录组学分析

为解析Na_(2)SeO_(3)诱导多形汉逊酵母DL-1(Hansenula polymorpha DL-1,HP-DL-1)生物合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)的分子机制。通过DTNB法以及Illumina测序平台对比分析不同浓度Na_(2)SeO_(3)对HP-DL-1合成GSH产量的影响及Na_(2)SeO_(3)诱导下GSH高产菌株与出发菌株转录组差异。结果表明:以60μmol/L Na_(2)SeO_(3)诱导HPDL-1发酵48 h,酵母总GSH产量达(530.22±9.6)mg/L;与对照组相比,Na_(2)SeO_(3)诱导组共有1254个显著性差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中630个DEGs表达上调,624个DEGs表达下调;依据基因本体(Gene Ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集,这些差异基因主要集中在细胞周期、有丝分裂、氨基酸生物合成、糖酵解、核糖体组分、甲烷、脂肪、核酸、GSH等多条代谢通路。本研究为分子改造构建高产GSH的酵母工程菌株提供一定参考。

多形汉逊酵母细胞工厂实现甲醇生物转化合成3-羟基丙酸

3-羟基丙酸(3-HP)是公认的高附加值化学品之一,可用于合成多种化学品,例如丙烯酰胺、丙烯酸、1,3-丙二醇以及可降解塑料.目前3-HP的生物合成过程均以糖为原料,且需求不断增长,亟需寻找不依赖耕地的替代原料.碳一资源来源广泛,是理想的生物制造原料.其中,甲醇可由煤、天然气制得,也可由CO_(2)加氢制备.多形汉逊酵母作为典型的甲基营养型酵母,能够以甲醇为唯一碳源和能源进行生长,并且能够耐受高温、高渗透压和低pH等条件,是非常优秀的工业菌株.近年来基因编辑技术的发展,大大加快了多形汉逊酵母代谢工程改造,有望构建高效细胞工厂,实现甲醇生物转化.本文以多形汉逊酵母为宿主,系统改造其细胞代谢实现甲醇高效转化为3-HP.由于汉逊酵母自身不能合成3-HP,因此需要表达来源于Chloroflexus aurantiacus的3-HP合成途径关键基因MCR,该途径以乙酰-CoA和丙二酰-CoA为前体,以还原力NADPH为辅因子.首先优化MCR表达,采用融合蛋白并结合甲醇诱导型启动子PAOX基因组整合MCR表达, 3-HP合成效率最高;其次,强化供应前体乙酰-CoA以及丙二酰-CoA,使3-HP产量提高26%;进一步改造氧化磷酸戊糖途径以增强辅因子NADPH的供应,使3-HP产量提高30%;最后,将增强前体和辅因子供应的有效策略结合,工程菌HP15相比出发菌HP07摇瓶发酵3-HP产量提高135%,达到1.45 g/L.通过摇瓶补料分批发酵, 3-HP产量达到7.10 g/L,得率达到0.14 g/g甲醇,为目前报道碳一资源合成3-HP的较高产量,表明多形汉逊酵母作为甲醇细胞工厂合成化学品具有很好的潜力.预期结合“液态阳光”CO_(2)制备甲醇技术以及甲醇生物转化过程,有望将CO_(2)制备成高附加值化学品,有助于实现碳中和.

多形汉逊酵母外源基因表达系统

多形汉逊酵母是一种有很大潜力的外源基因表达系统 ,已在科研和工业化生产上广泛应用。用它生产来源于真核生物的外源基因有许多优点 ,如重组菌减数分裂稳定、能进行正确的翻译后加工和修饰、表达量高等。许多有商业价值的蛋白质在这一系统中得到成功表达 ,有的已投入市场。本文综述多形汉逊酵母宿主菌的生物学特性、基因工程操作技术。

多形汉逊酵母作为细胞工厂的应用研究进展

多形汉逊酵母以其独特的生物学和遗传学特征已成为一种重要的细胞工厂,被广泛运用于生产药物蛋白、酶制剂、生物能源及药用植物有效成分等。作者概述了多形汉逊酵母的一些基本特性,阐述了其作为微生物细胞工厂的应用研究进展,并对其未来工作的前景进行了展望。

多形汉逊酵母破壁抽提的研究

实验以多形汉逊酵母为原料,采用自溶结合外加酶法制备酵母水解物。研究了自溶时间、氯化钠浓度、初始pH值、温度、木瓜蛋白酶添加量等因素对多形汉逊酵母水解的影响。结果表明:15%酵母悬浮液(以酵母干重计)在温度50℃,pH 5.5,氯化钠浓度为3%,木瓜蛋白酶添加量0.02%(w/w)的条件下水解32h,上清液中氨基酸态氮的含量最高,达到0.64g/100mL,其固形物得率为56.32%。

多形汉逊酵母研究进展

作为研究甲醇代谢、过氧化物酶体稳态和硝酸盐吸收的模式生物,多形汉逊酵母近年来在基础研究领域日益受到重视。在工程应用领域,利用多形汉逊酵母表达真核外源基因有特殊的优势。譬如容易得到高拷贝,在含油酸的培养条件下能够表达膜蛋白等。已有多种外源蛋白在多形汉逊酵母系统中得到表达。本文综述了多形汉逊酵母的基本生物学性质、基础研究领域概况及其在外源基因表达方面的特点和进展。

多形汉逊酵母提高生长性能的培养基优化

为了提高甲醇酵母多形汉逊的生长性能并降低发酵成本,对其培养基中维生素和氨基酸有效成分进行优化。通过单因素实验和响应面实验相结合,最终确定了两种优化后的培养基组成,分别是以葡萄糖为碳源时的培养基,(NH4)2 SO42.5 g/L、KH2 PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、葡萄糖20 g/L、生物素0.005 mg/L、甲硫氨酸40 mg/L、谷氨酸200 mg/L、天冬氨酸200 mg/L;以甲醇为碳源时的培养基,(NH4)2 SO42.5 g/L、KH2 PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、甲醇10 g/L、生物素0.005 mg/L、维生素B11.04 mg/L。这两种培养基分别将菌种生物量(OD 600)提高了6倍和1.5倍。优化后的葡萄糖培养基细胞中丙酮酸羧化酶活性提高了1倍,甲醇培养基细胞中丙酮酸脱氢酶酶活性提高3倍以上,丙酮酸羧化酶活性提高了8倍左右。综上,本研究为汉逊酵母大规模发酵提供了参考。

多形汉逊酵母启动子的挖掘

多形汉逊酵母可以利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源,是构建微生物细胞工厂的潜在宿主,在代谢工程改造和重组蛋白生产中引起了广泛关注。在合成生物学研究和代谢工程改造过程中,通常需要改变相关基因的转录水平来调节代谢通量,而这一过程需要借助不同种类、不同表达强度的启动子来实现。因此,对汉逊酵母糖酵解途径和活性氧(ROS)防御途径相关基因启动子进行挖掘,将其与GFPuv融合,通过测定荧光值的大小,分析汉逊酵母中相关启动子对不同碳源的响应情况及其表达强度。结果发现:在汉逊酵母中,含有多种不同强度的甲醇诱导型和组成型启动子,包括:强甲醇诱导型启动子P_(SOD1),强组成型启动子P_(ADH21)和P_(GAP);中等强度甲醇诱导型启动子P_(PGM2)、P_(SOD3)和P_(SOD2),中等强度组成型启动子P_(PFK2)、P_(GPI)和P_(ADH22);弱甲醇诱导型启动子P_(GSH)、P_(MSR)和弱组成型启动子P_(PGM1)、P_(SOD4)和P_(GPX)。这一研究结果将促进多形汉逊酵母在代谢工程改造和相关基础研究中的应用,为实现汉逊酵母细胞工厂提供理论依据。

利用组合策略提高汉逊酵母发酵生产D-阿拉伯糖醇

[目的]提高多形汉逊酵母发酵生产D-阿拉伯糖醇的产量。[方法]通过正交试验确定了用多形汉逊酵母DL-1发酵生产D-阿拉伯糖醇发酵培养基的最佳组分,进而结合培养温度对发酵过程的影响,获得运用变温策略提高多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法。[结果]最优发酵培养基组分为:葡萄糖200 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母浸粉12 g/L,Triton X-100 10 g/L,硫酸铵3.0 g/L,七水硫酸镁2.5g/L,磷酸二氢钾2.5 g/L;多形汉逊酵母DL-1的最适生长温度和D-阿拉伯糖醇最适合成温度分别为37℃和34℃;变温调控发酵方法为:将发酵培养基在37℃培养24 h后,升温到48℃继续培养24 h,再降温至34℃继续培养96 h得到发酵液。采用该方法发酵结束后D-阿拉伯糖醇产量为114.92 g/L,比恒温发酵(37℃、48℃、34℃)分别提高了30.25%、208.66%、20.93%。[结论]该方法可以提高多形汉逊酵母发酵生产D-阿拉伯糖醇。

多形汉逊酵母的诱变及突变株的筛选

为获得多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)营养缺陷型突变株,以亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES)为诱变剂诱变多形汉逊酵母HP 1,使用制霉菌素对诱变后的菌悬液进行富集筛选,并对诱变筛选条件进行了优化,筛选出16株ade、11株ura、8株leu营养缺陷型突变株及1株ura、Mut-(不能利用甲醇)双突变株。

富硒GSH多形汉逊酵母的制备工艺及其抗氧化活性

本实验以多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha,H.polymorpha)无机硒转化率及其胞内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)产量为评价指标,通过单因素实验、正交试验研究亚硒酸钠(Na_2SeO_3)添加量、添加时间、接种量等参数,确定制备富硒-GSH多形汉逊酵母的最佳发酵工艺,利用MTT比色法研究制备的富硒-GSH多形汉逊酵母对大鼠的抗氧化活性。结果表明,在4%接种量、37℃培养温度、120 r/min转速和发酵培养12 h后(48 h发酵周期)添加终浓度为30μg/m L Na_2SeO_3的条件下,多形汉逊酵母无机硒转化率及其胞内GSH产量为97.28%±1.89%和(215.21±3.01)mg/L。同时,与出发多形汉逊酵母组相比,饲喂富硒-GSH多形汉逊酵母组的SD大鼠的血清和肝脏中,GSH水平分别提高39.5%(p<0.01)、45.2%(p<0.001),T-AOC提高46.3%(p<0.01)、45.2%(p<0.05),GSH-Px提高48.3%(p<0.001)、52.3%(p<0.01),SOD提高68.4%(p<0.01)、45.1%(p<0.05),CAT提高39.5%(p<0.01)、49.6%(p<0.001),MDA降低21.3%(p<0.05)、38.5%(p<0.01)。表明富硒-GSH多形汉逊酵母可显著提高大鼠的抗氧化活性。研究结果为利用多形汉逊酵母高效、低成本协同制备有机硒和GSH提供新思路、新途径,并为其在保健食品开发领域的应用提供技术支撑。

果糖对多形汉逊酵母硒代谢及转录组的影响

富硒酵母具有机硒含量高、生理活性好、安全无毒等优点,是硒补充剂的重要来源之一。该研究分别以果糖和葡萄糖为碳源,探讨果糖对多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)硒代谢及其基因表达的影响。通过HPLC-ICP-MS方法和二代测序分析酵母中硒代蛋氨酸(selenomethionine, Se-Met)和转录组变化。与葡萄糖发酵组相比,果糖发酵组酵母生长减缓,但其胞内Se-Met含量呈增加趋势;2个发酵组之间的显著性差异表达基因(differential expressed genes, DEGs)数量为221个;GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集结果表明,这些DEGs主要富集在果糖和甘露糖代谢、糖酵解、磷酸戊糖通路、三羧酸循环等碳代谢,以及谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸、硒复合物等多条代谢通路中。该研究为进一步分析果糖对多形汉逊酵母菌中硒代谢调控机制及富硒酵母发酵工艺优化提供参考。

利用变温提高汉逊酵母发酵生产谷胱甘肽的研究

依据温度对细胞代谢过程的影响,建立了一种提高谷胱甘肽(Glutathione,GSH)产量的方法。通过单因素实验确定了多形汉逊酵母DL-1的最适生长温度、GSH合成的最佳温度和培养基初始pH分别为30、37℃和pH6.5;接着,通过变温调控分批发酵,确定最佳变温条件为:45℃培养16h后将温度降低为37℃继续培养32h,采用该方法摇瓶发酵后GSH总量及GSH含量分别为420.76mg/L和105.19mg/g,比恒温培养(37℃)分别提高了2.34倍和1.27倍,即胞内GSH积累幅度显著升高;最后,通过5L发酵罐扩大培养,生物量和GSH总量分别达42.35g/L和927.68mg/L。实验结果表明该方法可用于提高利用多形汉逊酵母的GSH产量。

绵羊PrP前体蛋白基因真核表达载体的构建及汉逊酵母中的初步表达

根据已知的绵羊PRNP基因序列设计引物,扩增出完整的PrP前体蛋白基因,将获得的基因克隆到pGEM-T载体中,得到插入PrP前体蛋白基因的pGEM-T-OPrP质粒,经PCR、酶切、测序鉴定后,用EcoRI和NotI从pGEM-T-OPrP上切下目的片段后,连接到汉逊酵母表达载体pFMDHZ-α-A中,通过PCR、酶切、插入鉴定保证正确插入后,经电转化将重组质粒pFMDHZ-α-A-OPrP转入多形汉逊酵母中,随后通过甲醇诱导进行表达。本研究表达的绵羊PrP前体蛋白,为绵羊痒的检测及诊断、PrP的结构与功能研究奠定基础。

人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白在多形汉逊酵母中的优化表达

为了实现人乳头瘤病毒(Humanpa pillomavirus,HPV)16亚型衣壳蛋白L1在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中的高效表达,根据L1蛋白的氨基酸序列及多形汉逊酵母的密码子偏爱性,对L1蛋白的编码序列进行优化设计,合成了完整的编码序列,命名为HPV16L1。以甲醇诱导型启动子MOXp和终止子AOXTT为表达调控元件,以尿嘧啶合成相关基因URA3为筛选标记,构建了HPV16L1的重组表达质粒pYMOXU-HPV16。用SacII酶切质粒pYMOXU-HPV16使其线性化,电转化多形汉逊酵母菌株H-ura3,依据营养缺陷互补筛选重组菌株。通过PCR扩增及HPV16L1蛋白表达量分析表明已获得稳定高表达L1蛋白的重组汉逊酵母菌株HP-U-16L。摇瓶发酵条件的初步优化表明,以YPM(pH7.0)为基础培养基进行诱导培养,控制接种量使初始培养液OD600为1.0,每隔12h补加甲醇至终浓度为1%(V/V),37oC、200r/min条件下诱导培养72h后,HPV16L1蛋白的最高表达量为78.6mg/L。本研究为多形汉逊酵母源HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

谷胱甘肽高产酵母融合子的制备及发酵工艺

为构建谷胱甘肽(glutathione,GSH)高产酵母菌株,本实验利用原生质体融合方法制备多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母融合子,结合自主设计的耐高温、钼酸钠和乙醇耐受性培养基方法高通量筛选酵母融合子,进而利用DTNB法定量测定GSH高产酵母融合子,并分析GSH高产酵母融合子的遗传稳定性,最后对其发酵工艺进行研究.结果表明,本实验利用原生质融合方法成功构建一株GSH产量高、遗传稳定的GSH高产酵母融合子,为低成本、高效生产GSH提供了新途径.

一步重组法构建产龙胆苦苷酵母重组菌的研究

利用低能N+注入介导秦艽基因组DNA转化多形汉逊酵母技术,结合颜色反应、薄层层析和高效液相色谱等方法筛选重组菌株,获得1株遗传稳定的能生物合成龙胆苦苷的重组酵母菌,被命名为DL-49.经液体培养90h后,利用HPLC分析其发酵液中的龙胆苦苷,其产量为2.22mg/L.将重组菌株传代培养8代后,分析显示重组酵母菌生物合成龙胆苦苷的产量基本稳定.试验表明,采用低能离子注入介导秦艽基因组转化酵母技术,可以在龙胆苦苷生物合成相关基因信息未知的情况下,直接获得能生物合成龙胆苦苷的酵母重组菌.

多形汉逊酵母代谢改造生产脂肪酸及发酵条件优化

脂肪酸作为一种化工原料,在生物能源、化妆品、个人护理产品和工业润滑剂等领域具有广泛应用。多形汉逊酵母因其能够利用甲醇、耐高温、底物谱广等优点,被认为是微生物细胞工厂的理想底盘宿主。本研究首先通过代谢工程构建了产脂肪酸的汉逊酵母细胞工厂。在此基础上,通过发酵条件优化进一步提升了工程菌株生产性能。在温度37℃、pH 6.4、培养基碳氮摩尔比为120、种子液OD_(600)在6–8之间时,摇瓶中工程菌脂肪酸产量达到1.86 g/L。在发酵罐中,采用溶氧(DO)关联法控制补料速度,初始培养基碳氮摩尔比为17.5,在DO高于30%时,补料碳氮摩尔比为120的葡萄糖培养基,脂肪酸产量达到18.0 g/L,显示了汉逊酵母作为脂肪酸合成细胞工厂的潜力,为实现工业化奠定了坚实的理论与应用基础。

木质纤维素合成化学品研究获进展

2023年8月30日,从中国科学院大连化学物理研究所获悉,该所合成微生物学研究组周雍进研究员团队在木质纤维素生物炼制方面取得新进展。研究团队以多形汉逊酵母作为细胞催化剂,将木质纤维素生物炼制高效合成脂肪酸和3-羟基丙酸等化学品。该项研究有望为可再生原料生物转化合成高附加值化学品奠定基础。