茄子SSR多态性引物的筛选及品种纯度鉴定

为应用分子标记建立一套快速准确的杂交种鉴定方法,利用已有的236对SSR分子标记对3个茄子品种进行多态性标记筛选,并进行待测品种的分子标记纯度鉴定以及田间纯度鉴定,获得特定品种的指纹信息。结果显示,筛选出用于茄子纯度鉴定的多态性引物15对,利用该系列引物进行纯度鉴定,品种1-2010、3-2010和9-2010纯度结果分别为98%,96%和100%,在此基础上获得了对应品种的指纹信息。应用SSR进行茄子品种纯度鉴定与田间检测结果一致,证明分子标记检测茄子杂交种纯度可行且高效,具有一定的理论和应用价值。

西花蓟马ISSR-PCR多态性引物及退火温度筛选

西花蓟马是近年来在我国局部地区爆发成灾的重要外来入侵害虫,为进一步研究西花蓟马的遗传多样性和种群遗传结构,对100条ISSR分子标记引物对西花蓟马基因组DNA的扩增情况进行了初步筛选,并利用4个地区的西花蓟马种群研究了其扩增多态性和最佳退火温度。结果表明:100条ISSR引物中有51条引物在西花蓟马基因组DNA中有扩增产物,其中,多态性引物12条,分别为UBC815、UBC834、UBC835、UBC840、UBC844、UBC845、UBC853、UBC864、UBC868、UBC874、UBC879和UBC899,其最佳退火温度依次为48℃、56℃、52℃、50℃、54℃、58℃、50℃、52℃、48℃、58℃、44℃和56℃。12条ISSR引物在4个地区的西花蓟马种群共检测到68个扩增位点,其中,多态位点31个,多态性比率(P)为45.59%;其遗传距离变化范围为0.132～0.338;在4个地区中,昆明和玉溪的西花蓟马亲缘关系最近。

草鱼基因组随机扩增多态性引物及多态性位点的筛选

为了建立草鱼基因组DNA多态性分析的指标体系,应用RAPD技术,从180条10碱基随机引物中筛选出了31条能扩增出多态性DNA片段的引物。用这31条多态性引物共扩增出了327条重复性好、带型清晰、分辨率高的谱带。扩增产物的片段大小范围在400—2000 bp之间。单一引物扩增条带为5—14条。用这些多态性引物在草鱼基因组DNA中检测到了93个多态性位点,并对这些多态性位点上的等位基因频率进行了统计分析。这31条多态性引物和所检测到的93个多态性位点初步为草鱼基因组的多态性分析提供了可靠的分析指标体系。

随机引物扩增DNA多态性技术在分析金黄色葡萄球菌和肺炎杆菌多态性中的应用

金黄色葡萄球菌和肺炎杆菌是医院内感染的主要条件致病菌 ,常常引起院内感染及暴发流行。本实验以一条含 10bp的随机引物将 5 2株肺炎杆菌和 2 8株金黄色葡萄球菌的DNA进行随机引物扩增DNA多态性 (RAPD)扩增 ,进行多态性分析 ,得到不同的带谱 ,在肺炎杆菌中存在很强的多态性 ,出现了 41种带型 ,通过肺炎杆菌间相似系数计算 ,绘制出表达菌株亲缘关系的系统树 ,图中可见各菌间的相似系数 ,5 2株菌分成 7个型 ;金黄色葡萄球菌出现了三条特征带。本实验说明RAPD技术能够追溯传染源 。

随机引物多态性DNA及其在微生物分型中的应用

用于微生物分型的现代技术包括表型和基因型方法。随机扩增多态性DNA（RandomAmplifictedPolymorphicDNA简称RAPD）是在PCR技术基础上发展起来的一种新的基因分型法。主要特点是利用随机寡核苷酸引物扩增基因组DNA片段，进而通过凝胶电泳分析其指纹图特征借以显示不同菌株间存在细微差别。这种方法简单、快速，现已在许多微生物分型中得到运用。

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

【目的】针对毛白杨优树种质资源形态学差异小、不易区分等问题,利用多态SSR引物构建优树种质资源指纹图谱,为毛白杨种质资源管理、新品种选育、知识产权保护等提供参考。【方法】本研究以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,从毛白杨SSR多态引物筛选入手,通过荧光SSR引物PCR扩增和毛细管电泳仪检测筛选SSR引物,并构建指纹图谱。【结果】在2 317对SSR引物中,共计得到清晰、特异、多态、稳定扩增的SSR引物406对,这些SSR引物在19条染色体上的分布数量介于3~39对之间,利用BLAST比对分析可将其中389对SSR引物定位到毛果杨基因组,构建了毛白杨优树种质资源多态SSR引物库。应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的技术策略,筛选出25对多态性较高的SSR核心引物,以及13对特异的SSR辅助引物,构建了毛白杨种质资源库内469个优良无性系指纹图谱库,并完成了指纹图谱的QR编码。【结论】本研究成功构建了毛白杨种质资源多态SSR引物库和优树无性系指纹图谱库,对与毛白杨类似的林木种质资源遗传变异研究以及品种鉴定、系谱分析等具有重要意义。

川渝部分地区野生黄鳝RAPD引物筛选及其在绵阳群体的验证

采用RAPD技术对产自四川绵阳、内江、雅安和重庆忠县的24尾野生黄鳝基因组DNA进行引物筛选,40条随机引物中有4条引物扩增出片段。选择在4个地区黄鳝个体间多态性较丰富的RAPD引物A10在绵阳黄鳝群体进行扩增分析。RAPD引物A10在6个绵阳黄鳝个体的扩增,产生比较清晰的条带并且呈现一定的多态性,绵阳黄鳝群体内的平均遗传相似率为0.8947,群体内的平均遗传距离为0.1053,从一定程度反映出绵阳地区黄鳝较低的遗传多样性。本研究所筛选引物可为黄鳝分子标记和遗传多样性的分析、亲缘关系和种质的鉴定以及遗传资源的保护利用提供参考。

山苍子AFLP反应体系的建立及其引物筛选

通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾3种组织的DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的4个主要因素(酶切时间、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究,建立了适合于山苍子AFLP分析的技术体系。结果表明,山苍子的顶芽是较好的DNA提取材料;山苍子基因组DNA经5 U EcoR I和5 U Mse I酶切1 h即可完全酶切;最佳的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0 U rTaq聚合酶、2.0μL 10×PCR缓冲液、1.8μL 25mmol.L-1MgCl2、1.4μL 2.5 mmol.L-1dNTP、100 ng.μL-1引物各1.0μL。使用该反应体系获得了清晰、稳定的DNA指纹图谱,并筛选出10对多态性较好的AFLP引物组合,为利用AFLP标记技术进一步开展山苍子种群遗传结构、遗传分化等研究奠定了基础。

降香黄檀SRAP分子标记的引物筛选

采用改良CTAB法提取降香黄檀基因组DNA,选用4个降香黄檀DNA作模板,对256个SRAP引物组合进行筛选。以条带清晰、多态性丰富为引物筛选原则,最后共筛选出25个组合作为降香黄檀SRAP分子标记的核心引物,为后续SRAP分析提供依据。

基于芭蕉属EST序列的地涌金莲SSR引物开发

对31 308条来自NCBI的芭蕉属(Musa)EST序列进行拼接得到全长为13.51 Mb的21 129条无冗余EST序列(含3 818条contigs及17 311条singletons),其中,4 944条(23.40%)EST序列含有5 416条SSRs,SSR的出现频率为25.63%,平均分布距离2.49 Kb,有234条(1.11%)含有1个以上的SSR。在所检测的SSR中,二、三、四核苷酸重复是主导重复类型,分别占EST-SSR总数的21.80%(1 181条)、52.55%(2 846条)和14.55%(788条)。AG/CT、AAG/CTT与AGG/CCT和AAAG/CTTT与AAAT/ATTT分别是二、三、四核苷酸的优势重复基元。随机设计了238对EST-SSR引物在24个地涌金莲个体中进行筛选,116对有扩增产物,其中,78对EST-SSR引物扩增出清晰稳定的目的片段,49对引物表现出多态性。本研究检测的15对引物扩增等位基因数范围是2～7个,平均3.067个;表观杂合度(Ho)范围是0.042 0.750,平均0.250;期望杂合度(He)范围是0.232～0.823,平均0.522。

利用重测序技术开发高粱多态性SSR分子标记

SSR分子标记由于具有成本低廉、容易操作等特性,使其在分子标记辅助育种中广泛应用。目前高粱SSR标记多基于测序已经完成美国高粱品种BTX623基因组开发,在应用中筛选多态性标记的效率低。对不育系和恢复系组成的26个高粱材料进行了重测序,然后进行生物信息学分析,最终开发了在26份材料中至少含有2种多态型的SSR标记24441个。这些SSR标记在26份材料中表现出的基因型多态类型在2-7种之间,2种的有16694个,7种的仅有77个。另外本研究还进行了筛选单拷贝基因处的多态性SSR分析,共筛选到6733个。随机挑选均匀覆盖10条染色体的单拷贝基因处SSR标记50对,利用辽宁高粱杂交种辽糯3号进行测试,其中49对能扩增出产物,成功率高达98%。其后利用2个品种和74份微核心种质资源测试表明,50对SSR标记在2个品种中有18对表现出多态性,挑选了一对引物在74份微核心种质中可见8种多态型。本研究表明利用不育系和恢复系材料进行重测序能有效开发多态性高的SSR标记。

基于白木香ESTs的沉香属SSR分子标记引物筛选

通过对白木香样品的454GS FLX Titanium高通量测序,获取了大量白木香EST序列,从中搜索出956个SSR,根据引物设计标准,设计了44对EST-SSR引物。在合适的PCR反应体系下,以海南白木香样品的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有22对EST-SSR引物能较好地扩增出产物。在沉香属3个种9份样品中进一步对这些可扩增的引物进行多态性初步验证,所筛选引物均可在所有沉香属样品中使用,为后续白木香居群及沉香属植物遗传多样性分析奠定基础。

神经外科病房金黄色葡萄球菌的耐药性及MRSA基因多态性研究

目的了解某院神经外科病房金黄色葡萄球菌的耐药性及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分子流行病学特点。方法采用纸片扩散法检测2008-2011年从神经外科住院患者分离的金黄色葡萄球菌254株的耐药性,MRSA的鉴定采用头孢西丁纸片扩散法和检测femA、mecA基因的双重PCR方法;采用随机引物多态性技术(RAPD)对分离的32株MRSA做同源性分析。结果神经外科病房MRSA的分离率92.9%,对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺的敏感率为100%,对复方新诺明和克林霉素的敏感率分别为82.3%和74.4%,对左氧氟沙星、环丙沙星、红霉素和青霉素耐药率均大于95%;32株MRSA的RAPD图谱有4种类型(Ⅰ-Ⅳ型),Ⅰ型20株(62.5%),Ⅱ型7株(21.9%),Ⅲ型3株(9.3%),Ⅳ型2株(6.2%)。结论某院神经外科病房存在基因型为Ⅰ型的MRSA菌株的暴发流行。

白三叶转录组SSR位点特征分析及引物开发

本研究旨在了解白三叶(Trifoliumrepens)SSR位点信息和序列特征,开发多态性SSR引物,区分20份白三叶材料。对白三叶不同颜色的花瓣进行转录组(RNA-seq)测序,并根据转录组测序结果中的SSR位点批量设计引物,随机选择60对引物进行多态性验证,选择多态性高的引物指纹图谱构建。结果表明,白三叶转录组中含有SSR位点的序列有24960个,出现频率为13.25%,平均约5.29 kb出现1个SSR位点;白三叶转录组SSR重复碱基类型有6种,其中三碱基重复占比最高(33.70%),其次为双碱基(28.26%)和单碱基重复(25.02%),其他碱基重复类型较低,仅占总SSR的9.01%。A/T(24.85%)、AG/CT(16.48%)和AAG/CTT(8.89%)分别为单碱基到三碱基的优势重复单元;单碱基至六碱基各基元重复次数集中在4~21次,占总数量的98.11%;序列长度变化在12~35 bp,占总数的96.43%;根据SSR位点序列设计出18594对引物,占总SSR的74.50%;60对随机引物中能扩增出条带的有52对,多态性引物17对,分别占86.7%和32.7%;以多态性较高的5对引物构建的白三叶指纹图谱,能够有效地将20个不同白三叶品种区分开。本研究中白三叶转录组SSR位点分布频率高,类型丰富,具有较高的多态性,在白三叶遗传多样性分析、分子标记辅助育种和指纹图谱构建中具有较大的应用潜力。

四川几个山羊品种(群体)与岩羊RAPD分析

以两组40个随机引物,筛选出16个重复性好的多态引物,对四川5个山羊品种、藏山羊两个生态类型、3个杂交群体和岩羊共计113只个体,进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析。结果表明:16个引物扩增出67条带,其中54条带呈现多态,多态率为80 60%。山羊各群体共有条带为23条,山羊和岩羊共有条带为13条,岩羊有4条特异带。不同引物所扩增出的片段在各群体中分布频率不同。山羊群体间相似系数为0 8216 0 9362,其中,安哥拉山羊与建昌黑山羊杂交后代F2和F3之间相似系数最大,为0 9362。山羊各群体与岩羊相似系数为0 4996 0 5064。山羊群体间的遗传距离为0 0638 0 1784。山羊各群体与岩羊的遗传距离为0 4936 0 5403。高原型藏山羊与山谷型藏山羊间的遗传距离小(0 1005)、相似系数大(0 8995),序列为TTCCGAACCC引物扩增出的片段为750bp,仅在高原型藏山羊中出现,可作为区分这两个生态类型的遗传标记。

用RAPD标记研究多花水仙若干品种类型的亲缘关系

利用随机引物多态性DNA(RAPD)技术分析了7个多花水仙品种类型,从260条随机引物中筛选出18条,共扩增出129条稳定条带,以此来计算品种类型间遗传相似系数,进行聚类分析,构建树状分枝图。结果表明:7个品种类型可分成四组:第一组I-1和I-2;第二组II-1和II-2;第三组III-1和III-2;III-3单独成为一组。

医院感染金黄色葡萄球菌的流行与耐药机制

目的对医院感染金黄色葡萄球菌进行基因分型,研究流行菌株的传播及其耐药的分子机制,以控制医院感染的发生。方法对分离的21株金黄色葡萄球菌进行RAPD分型,并进行mecA、gyrA、grlA基因分析,研究其耐药机制。结果21株金黄色葡萄球菌根据RAPD带型可分为3型,其中Ⅰ型12株,是医院感染的主要流行株;在临床分离的17株金黄色葡萄球菌中14株对甲氧西林和喹诺酮类均耐药;在耐药株中除1株(13064)外,其余菌株均检测出mecA基因;14株耐药株中均存在gyrA和(或)grlA突变;gyrA突变点为gyrA 84位TCA→TTA,gylA突变点为grlA80位TCC→TTC。结论RAPD基因分型技术简便快捷,可为医院感染金黄色葡萄球菌准确分型,是分子流行病学研究的有效方法;医院医院感染的金黄色葡萄球菌流行株主要为Ⅰ型,有可能经飞沫传播;17株临床分离株中14株存在多重耐药,并有相应的基因变异。

家蚕伴性赤蚁基因(sch)连锁的RAPD标记及相关分析

家蚕伴性赤蚁基因(sch)温敏性的发现为雄蚕品种选育研究开辟了新的途径。为获得sch基因的DNA序列,采用RAPD技术,对sch的近等位基因系进行随机扩增,得到一条能稳定扩增、与sch基因连锁的特异片段,并对该序列进行了克隆、测序与分析。结果表明,该序列是家蚕固醇载体蛋白-x(sterol carrier protein x,SCPx)基因的一部分,根据测序结果命名为OPD02-759。设计特异引物进行PCR扩增和测序,获得了sch蚕SCPx基因的酮酯酰CoA硫解酶结构域(3-ketoacyl-CoA thiolase)的完整序列。序列长1107 bp,编码369 aa,分子量为39.3 kD,与正常家蚕该结构域有15个核苷酸的差异,翻译后有5个氨基酸的差异,且其中2个发生在保守区域,此突变正好是RAPD扩增时出现特异带的随机引物结合位点。

镇江地区结核分枝杆菌DNA指纹图谱分型及耐药性分析

目的：分析镇江地区结核分枝杆菌的DNA指纹图谱分型及耐药情况。方法收集174例疑似结核病患者痰液标本，通过鉴别培养基对硝基苯甲酸（ PNB）和噻吩－2－羟酸肼（ TCH）进行分枝杆菌菌型初筛，再通过本室建立的PCR－ELISA法明确鉴定结核杆菌菌种，用比例法进行药敏实验，用DNA随机扩增多态性（ RAPD）指纹分型法，对其中44株耐药人型结核分枝杆菌进行DNA指纹图谱分型。结果从174份标本中分离出人型结核分枝杆菌141株（81．03％），牛型结核分枝杆菌20株（11．49％），非结核分枝杆菌13株（7．47％），总耐药率42．53％；耐药率由高到低依次为异烟肼（INH）＞氧氟沙星（OFX）＞利福平（RFP）＞链霉素（SM）＞乙胺丁醇（EMB）＞卡那霉素（KM）＞卷曲霉素（ CPM）＞阿米卡星（ AKM）；非结核分枝杆菌对EMB、RFP、SM、INH的耐药率显著高于结核分枝杆菌（ P＜0．01）。复治组对EMB、RFP、SM、INH的耐药率显著高于初治组的耐药率（P＜0．01）。中、老年患者耐药率明显高于青年患者（P＜0．05或P＜0．01）。将44株耐药人型结核杆菌，用RAPD－PCR分型，并用NTsys 2．10e软件作聚类分析，共分为5型（Ⅰ型-Ⅴ型），其中以Ⅰ-Ⅲ型为主，占84．09％。各型的耐药率差异无统计学意义（P＞0．05）。结论本地区肺结核以人型结核分枝杆菌为主，结核杆菌总体耐药率和耐多药率相对较高。 RAPD指纹分型结果显示，该地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性，成簇类型是主要流行菌株。各型与耐药性无明显相关性。

25株多重耐药鲍曼不动杆菌同源性分析

目的分析临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)中仅对黏菌素和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CCOS-AB)菌株的同源性,为控制其流行暴发提供实验数据。方法收集并分析武汉市第一医院2012年1月至2013年12月临床分离的CCOS-AB菌株25株,采用琼脂稀释法测定其耐药性,随机引物多态性DNA扩增(RAPD)和琼脂凝胶电泳分析CCOS-AB菌株的同源性。结果电泳结果显示,25株CCOS-AB菌株分为12个克隆株,A型克隆包括2株,B型克隆包括5株,C型克隆包括6株,D型克隆包括2株,E型克隆包括3株,F、G、H、I、J、K、L型克隆各1株。结论该院2012-2013年期间CCOS-AB存在5型克隆株的院内流行,临床应加强院内感染控制。