用随机引物多态性DNA聚合酶链反应鉴别新的裂体吸虫X

目的 鉴定新的裂体吸虫χ的基因组 DNA。方法 应用随机引物多态性 DNA聚合酶链反应 (RAPD- PCR)对裂体吸虫χ(S.χ)和日本血吸虫 (S.j)的基因组 DNA进行分析鉴别。感染了S.χ和 S.j尾蚴的兔 4 5 d后杀死 ,各取成虫 5 0条 ,磨碎 ,用苯酚—氯仿抽提法提取基因组 DNA。反应在 PCR扩增仪上进行 ,应用 2 9个随机引物 ,1.4 %琼脂糖凝胶电泳后观察、照相。结果 2 9个引物中 2个引物 ,J0 1 碱基 CCCGGCATAA和 L1 2 碱基 GGGCGGTACT的扩增产物在两者间显示出明显的差异带。引物 J0 1 S.χ特异性条带 1条 ,S.j特异性条带 1条。引物 L1 2 S.χ特异性条带 3条 ,S.j特异性条带 1条。结论 S.χ和 S.j的基因组 DNA在 J0 1 和 L1 2 的 6个位点的序列有所不同 ,出现了差异带 ,这在种间进化方面有鉴别价值。

随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术用于蚊细胞的鉴定

本文应用随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术筛选出引物Pm,用此引物对淡色库蚊细胞系(CPP-512)、中华按蚊卵巢细胞系(Anso-242)、嗜人按蚊细胞系(Ana-104)、白纹伊蚊细胞株(C6/36)4种蚊细胞基因组DNA进行扩增,得出4个相异的多态性DNA扩增产物图谱,各自的DNA扩增条带的分子量(kb)为CPP-512:0.5、0.7、0.8、0.88、1.02、1.22;Anso-242: 0.5、0.88、1.02、1.13、1.22、1.5、2.1、2.4、2.5;Ana-104:0.64、0.98、1.2、1.28、1.4、1.53、1.8、2.3、2.6、3.3;C6/36:0.66、0.8、0.94、1.4、1.42、1.5、1.52、2.9。实验结果表明,随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术是一种简便易行、结果重复性好的先进生物学分类技术,引物Pm能满足同时鉴别3属蚊虫的4种蚊细胞的需要。

聚合酶链反应在研究DNA多态性中的应用

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction PCR)是一种体外DNA扩增技术,自1985年Saiki等首次报道PCR方法以来,PCR技术迅速发展,并已广泛应用于生命科学各个方面。如基因克隆、遗传病的诊断、传染病的诊断、癌基因的检测等,由于PCR技术特异性强,扩增效率高、快速、录敏,且能克服限制性片段长度多态性(RFLP)的局限性,因此,它被有效地应用于研究DNA多态性。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速检测脑脊液中病原菌的初步研究

目的探讨聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)快速检测病原菌的可行性,初步评价该法检测脑脊液中病原菌的意义。方法设计通用引物对不同细菌进行PCR-SSCP,同时利用该法直接检测脑脊液中的病原菌,并与细菌培养比较。结果不同细菌的SSCP图谱呈多态性可相互区别;标准菌株和临床菌株的SSCP图谱完全一致;6份化脑的脑脊液,PCR-SSCP检出5份有细菌,而细菌培养只检出1份有细菌;7份病脑两种方法均未检出细菌。结论PCR-SSCP技术可快速、敏感地检测脑脊液中的病原菌。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的 应用PCR SSCP技术快速检测耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变 ,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及 2 5株结核分支杆菌敏感分离株用PCR SSCP方法分别检测 ,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中 ,rpoB、KatG、rpsLPCR扩增产物PCR SSCP分别有 2 8株 (87.5 % )rpoB基因 ,19株 (5 9.3% )KatG基因和 2 3株 (71.9% )rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比有明显差异 ,而 2 5株结核分支杆菌敏感株的PCR SSCP条带与结核分支杆菌H3 7Rv相似 ,特异性为 10 0 %。结论 PCR SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变 。

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的 :探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平 (RFP)药物敏感性的可行性。方法 :应用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分别检测了 4 0株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因 ,随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变 ,并与药敏试验结果作对照分析。 结果 :所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。 4 0株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H3 7RV标准株相同 ,4 0株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照 ,用PCR SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为 93% ,特异性为10 0 %。结论 :结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变

目的 :分析瘢痕疙瘩成纤维细胞p5 3基因突变高发区第 4～ 8外显子的突变及其意义。 方法 :取手术切除的瘢痕疙瘩和非增生瘢痕各 12例 ,分别采用相应正常皮肤对照 ,体外培养成纤维细胞 ,采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术检测 p5 3基因的突变情况。 结果 :12例瘢痕疙瘩成纤维细胞标本中有 9例 p5 3基因外显子 4、5、6、7出现突变 ,非增生瘢痕标本和正常皮肤标本均未检出突变。 结论 :p5 3基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法对太白贝母鉴别检验的适用性探讨

目的:探讨聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)对于太白贝母的适用性。方法:采集太白贝母野生及栽培品,收集市场上太白贝母伪品,利用性状、PCR-RFLP鉴别法、DNA序列分析三种方法分析太白贝母与常见伪品的区别。结果:从性状上看,太白贝母栽培品与伪品往往非常相似,较难辨别;通过PCRRFLP方法可以正确、客观的鉴别太白贝母与常见伪品,基于ITS2的DNA条形码方法进一步验证了PCR-RFLP法的准确性。市场上太白贝母的伪品多为伊犁贝母。结论:PCR-RFLP鉴别法可准确鉴别太白贝母与其伪品;市场上太白贝母伪品较多,应加强监管。

聚合酶链反应限制性片段长度多态性检测雌激素受体基因型

目的建立一种简便、实用、准确的人雌激素受体(ER)基因型的检测方法以利于了解基因对骨量变异的调节。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)来扩增ER基因序列,用限制性内切酶PvuII对223例健康妇女和49例男性的ER基因扩增产物酶切,测定ER基因限制性片段长度多态性(RFLP)。结果汉族妇女ER基因pp、Pp、PP基因型频率分列为0.33、0.47和0.202;男性分别为0.429、0.469和0.102。结论该方法简便、准确、重复性好,适用于常规实验。ER基因(PvuII)多态性分布有一定的种族差异性。

聚合酶链反应-单链构象多态性分析在精子发生相关基因检测中的应用

用聚合酶链反应方法检测了染色体核型正常的２００例无精子症患者基因组ＤＮＡ中的ＤＹＳ１基因，发现８例有ＤＹＳ１的缺失。选择６０例ＤＹＳ１阳性患者进行聚合酶链反应单链构象多态性分析，发现１例有多态性的改变，提示ＤＹＳ１的点突变亦与无精子症相关。认为，对于ＤＹＳ１阳性的无精子症患者有必要进行聚合酶链反应单链ＤＮＡ多态性分析。

微流控芯片电泳-多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点

以微流控芯片电泳为检测平台,建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶消化成短片段,再将酶切反应产物与脱氧核糖核酸适配器(DNAadapter)相连;以连接产物为模板,分成两管,分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增;最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象,考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性,采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定结果完全一致。

应用单链构象多态性－聚合酶链反应研究我国大麦黄花叶病毒株系的分化

根据致病性差异，我国大麦黄花叶病毒（ＢａＹＭＶ）存在若干不同株系，血清学和核酸杂交等技术不能区分这些株系。但还由于致病性不同，各株系的核酸序列间必定存在差异。最近建立的单链构象多态性。聚合酶链反应（ＳＳＣＰ－ＰＣＲ）技术能灵敏而有效地诊断和区分核酸序列间的差异，从而进一步证实我国ＢａＹＭＶ不同株系的分化。

聚合酶链反应限制性内切酶消化法检测人载脂蛋白E基因多态性

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）与限制性核酸内切酶ＨｈａＩ消化相结合的方法建立一种简便、实用的人载脂蛋白Ｅ基因多态性检测方法。ＰＣＲ扩增含有编码１１２和１５８位氨基酸的基因片断序列，产物经ＨｈａＩ酶消化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳可见２～４条特定长度的ＤＮＡ条带易于判定ａｐｏＥ基因型。对１４４例汉族健康人群检测结果，ａｐｏＥ基因型及等位基因分布频率分别为：Ｅ２／２Ｏ，Ｅ３／３６８．７５％，Ｅ４／４２．７８％，Ｅ２／３１４．５８％，Ｅ２／４２．７％，Ｅ３／４１１．１１％；ε２８．６８％，ε３８１．６％，ε４９．７２％。本法适于普通实验室开展应用。

基于定量聚合酶链式反应技术的多囊卵巢综合征与促卵泡激素的受体基因多态性的相关性研究

目的多囊卵巢是造成不孕和子宫内膜癌等疾病的重要因素之一,该研究目的是探索多囊卵巢与相关单核苷酸的多态性位点相关性。方法该研究首先提出了一种改良的等位特异的定量聚合酶链式反应技术并对其进行了可靠性评估,随后对多囊卵巢患者和对照样本进行了卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点进行了分型鉴定。结果该研究结果显示其提出的改良的定量聚合酶链式反应方法进行单核苷酸的多态性位点分型准确度高,区分度好,与Sanger测序法获得的结果完全一致,能够很好的用于单核苷酸的多态性等多态性位点的分型鉴定;该实验对152例多囊卵巢患者和152例对照样本中卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点分型检测结果显示Thr307Ala和Asn680Ser两个位点的等位基因频率和基因型频率均呈现了与多囊卵巢之间的显著相关性。结论该研究结果表明卵泡刺激素受体基因的两个单核苷酸的多态性位点可能与多囊卵巢的发病密切相关,为深入探讨该疾病和进一步研究单核苷酸的多态性分型奠定了基础。

聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用

目的:探讨聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收的方法在基因改变检测中的应用。方法:实验于2004-09/2005-10在南方医院心内科实验室完成。样本来源:于2004-09/2005-08选择南方医院心内科收治的冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者123例,均符合WHO冠心病诊断标准,并经心电图、超声心动图、CT确诊。患者均知情同意。聚合酶链反应-单链构象多态性银染方法检测冠心病患者三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因改变,对1例怀疑存在基因改变样本的聚丙烯酰胺凝胶采用银染后单链胶回收,以胶回收后的单链聚合酶链反应产物为模板重复聚合酶链反应后进行测序。结果:在对三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因Exon7进行单链构象多态性检测时,发现一样本泳带异常,对其样本进行银染后胶回收,结合限制性内切酶酶切,证实此样本存在碱基改变,从而验证了非变性聚丙烯酰胺凝胶银染后胶回收的准确性和可行性。结论:经聚合酶链反应-单链构象多态性银染后的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶也可进行胶回收。聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中可以增强单链构象多态性基因突变检测的准确性,由于其无毒性、成本低及操作简单等优点,更易被实验人员所接受。

聚合酶链反应-单链构型多态性检测细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因变异

目的 :检测与分析淋病奈瑟菌 L 型的 cpp B基因 ,探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌 cpp B基因的影响。方法 :用青霉素诱导淋病奈瑟菌成为 L 型并获得稳定 L 型纯培养物 ,用 cpp B基因特异性引物以聚合酶链反应 (PCR)检测稳定 L型纯培养物的 cpp B基因和进行单链构型多态性 (SSCP)分析。结果 :淋病奈瑟菌的细菌型及其 L型都具有 cpp B基因扩增产物 ,但 PCR-SSCP分析可见异常泳动 DNA带型 (细菌型有 2条带、L型有 3条带 )。结论 :细胞壁缺陷淋病奈瑟菌仍然具有 cpp B基因 。

60株临床分离犬小孢子菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性鉴定

目的探索采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行犬小孢子菌的快速鉴定。方法采用真菌通用引物第1内转录间隔区(ITS-1)与第4内转录间隔区(ITS-4)对60株犬小孢子菌进行PCR扩增,然后利用限制性内切酶TaqⅠ和HinfⅠ分别对PCR产物进行酶切分析。结果真菌通用引物ITS-1和ITS-4在60株犬小孢子菌中均扩增出1条长约750 bp的DNA条带;2种内切酶HinfⅠ和TaqⅠ各自显示相同的酶切结果,酶切片段稳定而清晰。结论应用PCR-RFLP方法可以快速、敏感、特异地鉴定犬小孢子菌。

聚合酶链反应—限制性片段长度多态性检测载脂蛋白E基因多态性及初步应用

目的 :建立聚合酶链反应—限制性片段长度多态性 (PCR- RFL P)分析结合 DNA直接银染技术检测载脂蛋白 E基因多态性。方法 :选择江苏地区汉族健康人 16 8例及冠心病 6 3例 ,PCR扩增 Apo E基因第 4外显子包含编码第 112位和第 15 8位氨基酸残基的基因序列 ,cfo I限制性内切酶酶切后电泳 ,银染色后分析 Apo E基因型。结果 :汉族健康人群及冠心病人群 Apo E基因型频率分别为 :ε2 /2 0 .6 % ,0 ;ε2 /3 11.9% ,14.3% ;ε2 /4 1.2 % ,4.8% ;ε3/4 10 .7% ,17.5 % ;ε3/3 75 .0 % ,6 1.9% ;ε4/4 0 .6 % ,1.6 % ;Apo E等位基因频率分别为 :ε2 7.14% ,9.5 2 % ;ε386 .31% ,77.78% ;ε46 .5 5 % ,12 .70 %。结论 :PCR- RFL P方法快速、简便、准确性和可靠性高 。

聚合酶链反应在口腔放线菌基因多态性分析中的应用

放线菌是口腔固有菌群中的主要菌属,与龋病尤其是根龋的发生、发展有密切关系。因此,检出放线菌并对其进行基因多态性分析十分重要。近年来聚合酶链反应(PCR)已应用于口腔细菌的研究。本文就广泛应用于口腔放线菌基因多态性分析中的PCR技术:随机扩增多态性DNA、PCR限制性片段长度多态性分析和基因外重复回文序列PCR作一综述。