目的建立多房棘球蚴（泡球蚴）感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因（Serpina3g）实时荧光定量PCR（RT—qPCR）的检测方法及与常规RT—PCR检测方法的比较。方法肉眼直视下肝脏穿刺注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型，3个...目的建立多房棘球蚴（泡球蚴）感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因（Serpina3g）实时荧光定量PCR（RT—qPCR）的检测方法及与常规RT—PCR检测方法的比较。方法肉眼直视下肝脏穿刺注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型，3个月后将小鼠处死，Trizol法提取肝脏总RNA，反转录获得cDNA。依据Serpina3g的编码基因（NM_009251）保守序列，通过Primer5软件设计定量引物，以β—actin作为内参。以健康小鼠肝脏获得的cDNA依次10倍梯度稀释制备标准品（1×10^2～1×10^6pg），利用SYBR Green RT-qPCR方法检测Serpina3g基因，然后根据cDNA浓度与循环值（Ct）的线性关系，绘制标准曲线，确定RT—qPCR检测的最佳条件和重复性；并将RT—qPCR结果与常规RT—PCR琼脂糖凝胶电泳结果进行特异性、灵敏度和定量等方面的比较。结果筛选出Serpina3g基因定量引物，最佳退火温度为56．g℃；RT—qPCR无非特异性扩增，标准品及样品熔解温度均在80．5℃，熔解峰单一；标准曲线斜率为-2．833（效率），相关系数r=0．996：5个不同梯度的样本（1×10^2～1×10^6pg）重复检测5次均为阳性，变异〈5％；mRNA检出限为1×10^2pg，总RNA在1×10^2-1×10^6pg内均可以进行扩增；常规RT-PCR方法mRNA检出限仅为1×10^6pg。结论成功建立了小鼠源Serpina3g的RT—qPCR检测方法，在特异性、灵敏度、重复性和定量方面优于常规RT—PCR。展开更多
文摘目的建立多房棘球蚴（泡球蚴）感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因（Serpina3g）实时荧光定量PCR（RT—qPCR）的检测方法及与常规RT—PCR检测方法的比较。方法肉眼直视下肝脏穿刺注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型，3个月后将小鼠处死，Trizol法提取肝脏总RNA，反转录获得cDNA。依据Serpina3g的编码基因（NM_009251）保守序列，通过Primer5软件设计定量引物，以β—actin作为内参。以健康小鼠肝脏获得的cDNA依次10倍梯度稀释制备标准品（1×10^2～1×10^6pg），利用SYBR Green RT-qPCR方法检测Serpina3g基因，然后根据cDNA浓度与循环值（Ct）的线性关系，绘制标准曲线，确定RT—qPCR检测的最佳条件和重复性；并将RT—qPCR结果与常规RT—PCR琼脂糖凝胶电泳结果进行特异性、灵敏度和定量等方面的比较。结果筛选出Serpina3g基因定量引物，最佳退火温度为56．g℃；RT—qPCR无非特异性扩增，标准品及样品熔解温度均在80．5℃，熔解峰单一；标准曲线斜率为-2．833（效率），相关系数r=0．996：5个不同梯度的样本（1×10^2～1×10^6pg）重复检测5次均为阳性，变异〈5％；mRNA检出限为1×10^2pg，总RNA在1×10^2-1×10^6pg内均可以进行扩增；常规RT-PCR方法mRNA检出限仅为1×10^6pg。结论成功建立了小鼠源Serpina3g的RT—qPCR检测方法，在特异性、灵敏度、重复性和定量方面优于常规RT—PCR。
