基于纳米抗体的可再生免疫亲和柱结合高效液相色谱-串联质谱法测定玉米中的黄曲霉毒素B_(1)

目的研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxinB_(1),AFB_(1))纳米抗体的表达产量的影响因素,开发具有可再生性的AFB_(1)免疫亲和柱,构建免疫亲和处理-高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定玉米中AFB_(1)污染的分析方法。方法研究诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度等对AFB_(1)纳米抗体表达量的影响,比对验证AFB_(1)纳米抗体可再生免疫亲和柱的耐受性和可再生使用次数。使用70%甲醇水溶液提取玉米样品中AFB_(1),提取液通过免疫亲和柱净化富集后进行HPLC-MS/MS检测,最后进行方法学验证并应用到实际样品检测。结果诱导AFB_(1)纳米抗体表达的最优条件分别为诱导温度16℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间14 h,在最优条件下产量可达7.8 mg/L。AFB_(1)纳米抗体具有良好灵敏度、亲和性、特异性和甲醇耐受性,制备的AFB_(1)免疫亲和柱具有极好的可再生性,重复使用150次以上,对AFB_(1)回收率仍可达80%以上。同时,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS,在0.1~100.0μg/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.014μg/L,定量限为0.047μg/L。在3个不同加标浓度下,回收率在92.0%~104.1%,变异系数小于3.9%。结论本研究开发的AFB_(1)纳米抗体免疫亲和柱表现出优秀的再生性和高特异性,节约了检测成本,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS检测方法操作简便、回收率高、结果准确,适用于实际玉米样品中AFB_(1)的含量测定。

全自动免疫亲和柱净化-液相色谱串联质谱法同时测定饼粕类饲料原料中黄曲霉毒素

研究旨在建立全自动免疫亲和柱净化-液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)同时测定饼粕类饲料原料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)含量的分析方法。通过比较不同提取条件和净化方式对黄曲霉毒素(AFs)检测结果的影响,确定较佳前处理方法。样品经40%乙腈提取、磷酸盐缓冲液稀释,采用自动免疫亲和柱净化,得到的样品溶液使用LC-MS/MS进行定量分析。基于上述方法对花生粕、豆粕、棉籽粕等饲料原料样品进行分析测定,结果表明:AFs在0.02~10.00 ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.9950),方法定量限为0.1μg/kg,平均回收率为82.2%~109.8%,RSD≤8.9%。该方法可批量自动化处理样品,提高工作效率,避免因人员操作导致的结果偏差,适合于饲料原料中多种AFs的精准测定。

色谱技术在抗体分离纯化中的应用进展

抗体作为一类重要的生物药物,在疾病诊断和治疗等方面拥有广阔的前景。抗体药物的需求逐年上升,生产规模不断扩大,下游抗体纯化已经成为抗体药物生产的瓶颈。色谱技术具有选择性好、分离效率高等优点,在抗体纯化领域占据主导地位。抗体分离纯化流程一般包括样品的粗提、粗提物精制和抗体精纯3个步骤,每个步骤都涉及色谱分离技术。目前已有多种色谱技术(如亲和色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、混合模式色谱以及新型的温敏色谱等)应用于抗体的分离纯化。本文介绍了近年来国内外各种色谱技术在抗体分离纯化方面所取得的研究进展,并对抗体色谱分离技术的未来发展趋势进行了展望。

免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中4种黄曲霉毒素

目的:建立免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的含量。方法:样品采用70%甲醇作为提取溶剂,经免疫亲和柱净化、高效液相色谱分离、光化学柱后衍生后,通过荧光检测器测定其中黄曲霉毒素的含量。结果:黄曲霉毒素B_(1)的线性范围为0.0104~0.0520 ng(r=0.9999)、黄曲霉毒素B_(2)的线性范围为0.0038~0.0190 ng(r=0.9998)、黄曲霉毒素G_(1)的线性范围为0.0108~0.0540 ng(r=0.9998)、黄曲霉毒素G_(2)的线性范围为0.0038~0.0190 ng(r=0.9998),线性关系良好,回收率在89.68%~101.44%之间,RSD≤3.5%。结论:该方法操作简便,灵敏度高、重复性好、结果准确,可用于制马肾中黄曲霉毒素的测定。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的五氯苯酚

目的 构建复合免疫亲和柱净化,高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)测定母乳中五氯苯酚残留的分析方法。方法 母乳样品用5%三乙胺乙腈水(7:3, V/V)提取,经免疫亲和柱特异性净化,以含0.05%氟化铵的甲醇和含0.05%氟化铵的超纯水为流动相,梯度洗脱, ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式检测,内标法定量分析。结果 五氯苯酚在0.02~20.00μg/L范围内呈现良好线性关系,相关系数达0.9998;在低、中、高3个不同加标浓度下,回收率在98.72%~106.95%之间,相对标准偏差小于6.09%,基质效应在94.45%~101.61%之间;方法的检出限为0.008μg/L,定量限为0.02μg/L。免疫亲和柱在该实验条件下至少可重复使用8次,降低87%以上的实验成本。结论 本方法基于免疫亲和柱对样品进行特异性净化,重现性好、准确度高,能够有效地分离和检测母乳中的五氯苯酚残留,可应用于母乳样品中五氯苯酚的定性定量检测。

免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中8种霉菌毒素

目的:建立免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定水产品中8种霉菌毒素残留。方法:样品经乙腈水溶液(84:16,V:V)提取,多毒素免疫亲和柱净化。色谱柱为Agilent Proshell 120 SB·C_(18)(2.1 mm×100 mm,2.7μm),流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温为40℃。采用电喷雾离子源正负离子同时扫描,多反应监测模式(MRM)进行质谱检测。结果:8种霉菌毒素在1.0~50.0 ng/mL范围内线性关系良好(R2>0.992),方法检出限在0.05~0.50μg/kg之间,定量限在0.17~1.65μg/kg之间;8种霉菌毒素加标回收率在75.6%~106.3%之间,相对标准偏差(RSD)为3.5%~9.3%。结论:该方法操作便捷、灵敏度高、准确可靠,能满足水产品中多种霉菌毒素残留快速检测需求。

不同蛋白A亲和色谱填料的制备工艺比较及性能评价

蛋白A亲和色谱填料由于能够和免疫球蛋白G(IgG)特异性作用,已广泛应用于临床医学、生物医药领域。采用不同结构和形貌的基质,通过不同的表面修饰方法得到的填料性能差别很大。研究分别以常用的琼脂糖和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)小球为基质,通过多功能环氧基定向固定蛋白A制得琼脂糖基质亲和色谱填料(A-S)和PGMA基质亲和色谱填料(P-S)。通过马来酰亚氨基定向固定蛋白A制得琼脂糖基质亲和色谱填料(A-R)和PGMA基质亲和色谱填料(P-R)。通过对蛋白A的键合工艺加以优化,研究了基质种类、基质粒径以及蛋白A含量等条件对材料性能的影响,提高了材料对IgG的吸附性能。结果表明,尽管所制备的4类材料对IgG都有一定的吸附选择性,但P-R的性能明显更加优异,可在较低的蛋白A配基密度下达到较高的动态载量。制备了不同配基密度的亲和色谱填料,其中配基密度为15.71 mg/mL的P-R对牛免疫球蛋白的动态载量为32.23 mg/mL,对人免疫球蛋白的动态载量达到54.41 mg/mL,且在碱处理160个循环后动态载量仍为初始值的94.6%。耐压测试结果表明P-R的机械强度远高于同等条件下制得的琼脂糖基质的亲和材料A-R,当流速到达80 mL/min时,PGMA基质色谱柱的流速与压力仍保持较好的线性关系,P-R的耐压性能好,可以在更高的流速下进行分离纯化。以上结果说明以马来酰亚氨基在PGMA上固定蛋白A的工艺更适宜于蛋白A亲和色谱填料的工程化生产,所发展的方法有望在固定蛋白和免疫吸附材料合成领域发挥更大的作用。

嵌段共聚温敏亲和色谱固定相的制备及其对抗体的分离纯化

抗体药物在癌症治疗和免疫诊断中起着重要作用,但抗体的分离纯化通常采用酸性洗脱,易导致抗体聚集失活等问题。本研究以硅胶为基质,以温敏嵌段聚合物聚[(N-异丙基丙烯酰胺)-b-4-乙烯基吡啶](P[NIPAM-b-4VP])为间隔臂,以4-巯基乙基吡啶(MEP)为配基,制备了一种嵌段共聚温敏亲和色谱固定相SiO_(2)-P[NIPAM-b-4VP]-MEP,并以牛血清白蛋白(BSA)和γ-球蛋白为模型蛋白,对制备的温敏亲和色谱固定相的色谱性能进行了表征。分别考察了流动相盐浓度和温度对二者分离性能的影响。结果表明,在40℃时该固定相只选择性保留γ-球蛋白,而不保留BSA;在5℃时采用含0.6 mol/L NaCl的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲溶液进行洗脱,γ-球蛋白的质量回收率为92.7%。该固定相对γ-球蛋白的吸附量为(71.5±2.1)mg/g(n=3),是传统温敏亲和色谱固定相SiO_(2)-PNIPAM-MEP的2倍。将该固定相用于人血清中IgG的分离纯化,仅通过改变流动相温度和盐浓度即可一步实现对抗体的分离纯化,纯度大于97.4%±0.7%。上述结果表明该温敏亲和色谱固定相不仅对抗体具有特异的选择性,而且洗脱条件温和,绿色环保,从根本上解决了传统亲和色谱采用酸性洗脱易使抗体蛋白变性失活的难题。该技术在抗体药物的分离纯化和工业生产中具有重要的应用价值。

绿磺隆克百威三唑磷多抗体免疫亲和色谱技术研究

采用碳酰二咪唑(CDI)将Sepharose CL-4B活化并分别与纯化的抗绿磺隆、抗克百威、抗三唑磷的多克隆抗体共价偶联,合成相应的免疫亲和吸附剂,并制备了对绿磺隆、克百威和三唑磷具有特异性亲和力的多抗体免疫亲和色谱(MIAC)柱。对MIAC的条件进行优化,选择0.02mol·L-1pH7.2磷酸盐缓冲液作吸附与平衡介质,80%(体积分数)甲醇水溶液作洗脱剂。结果表明,在上述试验条件下,MIAC柱对绿磺隆、克百威和三唑磷的动态柱容量分别达1.81、2.29和1.89μg·mL-1床体积。用MIAC柱对添加有绿磺隆、克百威、三唑磷的河水与土壤提取液进行分离富集,洗脱液分别采用包被抗体直接竞争酶联免疫吸附(ELISA)法和高效液相色谱(HPLC)法测定,重复5次,平均回收率是89.98%～106.2%,相对标准偏差(RSD)为3.21%～14.81%,ELISA法和HPLC法的测定结果基本一致。成功建立了绿磺隆、克百威和三唑磷的多抗体免疫亲和色谱分析技术并用于河水和土壤中绿磺隆、克百威、三唑磷残留的测定。

利用鸡蛋特异性抗体IgY的免疫亲和色谱

以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为抗原，利用偶联上ＢＳＡ的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ的亲和色谱材料从鸡蛋蛋黄中一步分离特异性抗ＢＳＡ 抗体。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、双向免疫扩散检验，所洗脱的样品为电泳纯的特异性抗体。反之，将所得抗体再偶联到ＰＯＲＯＳＨＹ上可分离抗原。同时考察了母鸡免疫过程中特异性抗体随时间的变化趋势。

免疫亲和柱结合超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的16种真菌毒素比较研究

目的通过比较5种不同商品化多合一免疫亲和柱的可检测目标毒素种类、回收率和稳定性,筛选性能最优的免疫亲和柱,建立免疫亲和前处理-超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定牛奶中16种真菌毒的方法。方法牛奶样品分别经5种不同多毒素免疫亲和柱进行净化富集,用优化后的UPLC-MS/MS,在多反应监测模式下测定,同位素内标法定量,筛选覆盖牛奶中真菌毒素污染种类全面、回收率和稳定性最佳的免疫亲和柱,并进行免疫亲和柱性能评价和方法学验证,最终将方法应用于实际样品检测。结果免疫亲和柱A对牛奶中16种真菌毒素在低、中、高3个添加水平均具有良好的准确度和精密度,加标回收率在83.6%~126.8%之间,相对标准偏差为0.2%~18.4%。柱A内各毒素残留水平低于仪器检出限,柱容量在21.8~1317.5 ng之间。使用免疫亲和柱A富集净化样品,各目标毒素在线性范围内线性良好,相关系数均大于0.99,定量限为0.0010~0.2000ng/g。应用该方法对牛奶质控样品和实际样品进行检测,质控样品测定值均在标示范围内;实际样品中能够检出较低水平的黄曲霉毒素M_(1)、去环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马毒素B1。结论本研究验证筛选免疫亲和柱A应用于牛奶中16种真菌毒素的测定,其柱残留和柱容量能够满足牛奶中真菌毒素污染的测定;经方法学验证该方法准确可靠、灵敏度高,适用于牛奶中16种真菌毒素的日常检测。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱技术检测食品中呕吐毒素的方法优化

目的:建立了基于优化的免疫亲和柱净化高效液相色谱技术的呕吐毒素检测方法。方法:优化的免疫亲和柱淋洗条件为将1.5 mL甲醇以0.5 mL·min^(-1)的流速分3次洗脱;优化的流动相为乙腈∶水=10∶90。结果:当呕吐毒素的载柱量在12.4~2504.0 ng时,柱回收率为82.6%~103.2%;在98.6~4930.0 ng·mL^(-1)时,呕吐毒素的校正曲线为y=0.06335x-0.81590,相关系数为0.999921。以优化后的实验方法分析小麦粉、醋和黄酒中的呕吐毒素,检出限为1.2~4.2μg·kg^(-1),定量限为4~14μg·kg^(-1);3种食品中呕吐毒素的3水平平均加标回收率为84.3%~104.7%,实验室内变异系数为0.3%~5.5%;对特性值为1303μg·kg^(-1),特性值区间为1043~1563μg·kg^(-1)的小麦粉质控样品中呕吐毒素的含量进行检测,结果为1320μg·kg^(-1)。结论:优化后的检测方法灵敏、准确,适用于食品中呕吐毒素的检测。

PerfusionG蛋白亲和色谱测定人体生长激素与抗体免疫反应的活性和摩尔配比

首次报道了应用ＰｅｒｆｕｓｉｏｎＧ蛋白亲和色谱法快速测定人体生长激素与抗体免疫反应活性和摩尔配比的方法。这一新方法与传统的免疫测试技术相比较，具有快速、易于自动化操作和低劳动强度的优点。

免疫亲和柱净化-亲水液相色谱串联质谱法测定牛奶中的三聚氰胺

本文建立了牛奶中三聚氰胺的免疫亲和柱净化-亲水液相色谱串联质谱分析方法,样品经简单稀释即可经免疫亲和柱净化后用液相色谱串联质谱法检测,内标法定量。相关系数r~2为0.999 74,线性范围为1~100 ng/m L,最低检出限(LOD)为0.000 10 mg/kg,定量限(LOQ)为0.000 24 mg/kg,回收率在97.4%~100.6%。结果表明,该方法具有较高的准确度和灵敏度,可满足实际样品检测需求。

免疫亲和色谱-HPLC-FLD法测定动物肝脏中10种喹诺酮类药物残留

利用免疫亲和色谱净化技术建立了可同时检测动物肝脏组织中10种喹诺酮类药物(麻保沙星、环丙沙星、诺氟沙星、单诺沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹)的高效液相色谱检测方法。对利用喹诺酮抗体制备的免疫亲和色谱柱的性能、操作条件进行了考察和优化。抗体的偶联量为5g/L,其对10种喹诺酮药物的柱容量为3.75～6.67μmol/Lgel(1425～2135mg/Lgel),选用V(甲醇):V(PBS)=7:3作为洗脱溶液,连续使用12次后,QNs的柱容量仍能达到初始柱容量的38%～45%;IAC柱重复使用20次后,药物的回收率与样品的净化效果无明显变化。动物肝脏组织样品用PBS溶液提取,IAC柱净化,HPLC-FLD检测。方法的线性范围为0.15～200μg/L,相关系数大于0.9989,检出限为0.05～0.15μg/kg;10种喹诺酮类药物在动物肝脏的平均回收率为74.7%～94.8%,相对标准偏差为3.9%～12.1%。

测定玉米中伏马毒素的免疫亲和层析净化高效液相色谱法

伏马毒素(Fumonisins)是串珠镰刀菌繁殖产生的一类真菌毒素。玉米在生长和储存过程中极易受到伏马毒素的侵染。流行病学研究结果表明,受到伏马毒素污染的玉米及其制品可导致马白脑软化症、猪肺水肿综合症,还可诱发人类食管癌和胎儿神经管畸形等疾病。本研究建立了应用免疫亲和柱净化高效液相色谱测定玉米中伏马毒素B1和B2的方法,同时,运用统计学方法对该法进行了准确性和再现性评价。结果表明,FB1和FB2线性范围分别为0.06～5.00μgmL1和0.04～2.50μgmL1,回收率分别为76.6%～93.8%和77.9%～93.4%,FB1和FB2方法定量限分别为0.09mgkg1和0.06mgkg1,实验室内重复性测定的变异系数均低于5%,实验室间再现性测定的变异系数低于6%。上述结果说明该方法的线性、准确度、精密度、灵敏度及同一实验室重复性和多家实验室的再现性评价结果优良,适合作为伏马毒素的测定方法。应用该方法对310份玉米进行了伏马毒素的测定,结果表明,大田、存储玉米伏马毒素总量范围分别为0.20～9.06mgkg1和0.21～6.10mgkg1,建议应加强玉米中伏马毒素污染水平监控,保证人畜健康。

免疫亲和柱-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物

建立免疫亲和柱同时净化-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮)残留量的方法。样品经免疫亲和柱净化与富集后,用高效液相色谱-紫外检测器检测。采用Cloversil-C18反相柱分离,流动相为乙腈-甲醇-水溶液,检测波长为265 nm。结果表明,牛奶中添加氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的回收率在74%~101%,且相对标准偏差均小于7%。氯霉素的检出限为0.02 μg/L,玉米赤霉醇及其类似物的检出限分别为α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L和玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。该方法灵敏度高、重复性好,提高了检测速率,可满足牛奶样品中痕量氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物残留的测定。

免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定中药材中的14种真菌毒素

依次采用磷酸盐缓冲液(PBS)和甲醇-PBS溶液提取样品,以多功能免疫亲和柱净化,采用液相色谱-串联四极杆质谱检测,可同时测定中药材中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮等14种真菌毒素。优化条件下,真菌毒素的定量限(LOQ)为1～5μg/kg,4种中药材基质(人参、桔梗、板蓝根、麦门冬)中3个不同添加水平的平均回收率(n=6)为71.9%～99.7%,相对标准偏差(RSD)为4.8%～15.8%。该方法的检测速度快,中药材复杂基质的干扰较少,结果准确、可靠,定量限可满足国内外中药材真菌毒素相关限量的要求。

蛋白A高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G的含量

研究了蛋白Ａ高效亲和膜色谱对水溶液及人血浆中人免疫球蛋白Ｇ（ＨＩｇＧ）的特异性吸附和定量测定。方法具有较高的精确度和较好的重复性：ＨＩｇＧ标样５次重复进样的相对标准偏差为１．５％，人血浆样品３次重复进样的相对标准偏差为３．６％；所测得的定量标定曲线的线性相关系数达到０．９９９３；不含己二胺间隔臂的亲和介质的非特异性吸附极低，基本检测不出来。快速实验中，一次分析可在０．５ｍｉｎ内完成。实验表明，利用所建立的方法对人血浆中的ＨＩｇＧ进行定量测定可以得到较为满意的结果。

免疫亲和萃取-超高效液相色谱-串联质谱法分离测定中成药及中药材中的5种黄曲霉毒素

利用免疫亲和萃取结合超高效液相色谱-串联四极杆质谱技术(UHPLC-E S I/Q qQ-M S/M S)建立了中成药及中药材中5种黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2和M1)的提取、分离、确证与定量方法。样品经80%(体积分数)的甲醇水溶液提取和免疫亲和固相萃取后,采用UHPLC-E S I/Q qQ-M S/M S的多反应监测模式实现分离、鉴定和外标法定量。5种目标毒素标准溶液的检出限(LOD)为0.05～0.3μg/L。在0.5～100μg/L的基质添加浓度范围内具有良好的线性关系(r2>0.99);以甘草为例,当添加水平为1.0μg/kg和5.0μg/kg时,得到62.3%～82.4%的回收率(相对标准偏差(RSD)<10%,n=6)。该方法灵敏度高、选择性和重复性好、回收率较高、检测速度快,适用于中成药及中药材等复杂基体中多种黄曲霉毒素的快速分析与筛查。