一种多拷贝串联基因的链霉菌表达载体的构建方法

目的建立一种链霉菌外源基因多拷贝串联表达的载体构建方法。方法首先以链霉菌整合型载体p SET152为基础,构建表达载体p FIM001。该质粒携带链霉菌强启动子Perm E*,与下游外源基因组成表达盒;紧接着在载体p FIM001插入了tcs D基因构建质粒p FIM101,并且引入了XbaⅠ及SpeⅠ等位点;通过表达盒串联定向克隆法完成多拷贝tcs D的插入。结果成功构建外源多拷贝基因表达载体p FIM001,建立了表达盒串联定向克隆法,获得含不同拷贝tcs D基因的质粒。结论可以用这个方法构建多拷贝基因质粒。

多拷贝GnRH类似物的原核表达及其纯化

目的原核表达促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,Gn RH)类似物,并进行纯化。方法人工合成8拷贝Gn RH类似物基因,并利用同尾酶技术构建16拷贝的Gn RH类似物基因,将8和16拷贝串联的Gn RH类似物基因分别克隆至p GEX-2t原核表达载体上,构建Gn RH类似物基因多拷贝串联表达的重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21,利用优化后的IPTG诱导表达条件表达的重组Gn RH类似物蛋白经Glutathione Sepharose 4B柱纯化并酶解后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果质粒p GEX-2t-8Gn RH analogue和p GEX-2t-16Gn RH analogue经双酶切及测序证明构建正确。当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导2 h时,破菌后上清中目的蛋白表达量最高。表达的重组蛋白相对分子质量约37 000,可与兔抗Gn RH单克隆抗体特异性结合,纯化后的重组蛋白相对分子质量约1 400,蛋白浓度约260μg/ml。结论已成功构建Gn RH类似物多拷贝基因重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达,为多拷贝法生产生物活性小肽Gn RH类似物奠定了基础。