多囊蛋白1表达载体的构建及表达

目的 :体外表达并纯化多囊蛋白 1胞外区片段。方法 :提取健康人肾组织总 RNA,用一步法 RT- PCR选择扩增编码多囊蛋白 1胞外多拷贝区的 2个 c DNA片段 ,并将之克隆到融合蛋白表达载体 p QE30中 ,转染含有阻遏质粒 p REP4的大肠杆菌 M15。异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达融合蛋白 ,用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。 结果 :克隆到 2个编码多囊蛋白 1胞外区的 c DNA片段 ,其大小分别为 5 0 2 bp和 4 71bp。构建的表达质粒p QE30 - PK D1e1和 p QE30 - PK D1e2经限制性内切酶酶切和 DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为19 80 0、1890 0的融合蛋白 ,经蛋白质印迹分析鉴定为多囊蛋白 1的融合蛋白。结论 :本实验克服了 PK D1基因在体内多个同源序列的干扰 ,克隆了编码多囊蛋白 1胞外多拷贝区的 c DNA序列 ,并成功地获得了融合表达的目的蛋白 ,为进一步制备抗多囊蛋白

抗多囊蛋白1氨基端单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :用杂交瘤技术制备抗多囊蛋白 1胞外区氨基端的单克隆抗体 (mAb) ,并对其特异性进行鉴定。方法 :以肾组织总RNA为模板 ,用RT PCR扩增多囊蛋白 1胞外区氨基端的编码基因PKD1cDNA。将该基因克隆到融合蛋白表达载体pQE3 0中 ,转染大肠杆菌M15。以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达多囊蛋白 1胞外区氨基端的组氨酸融合蛋白 (PC1 e2 ) ,用亲和层析法纯化。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠 ,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2 / 0进行细胞融合 ,间接ELISA筛选阳性克隆 ,有限稀释法进行单克隆化。mAb的特异性用间接ELISA和Westernblot鉴定。结果 :克隆到两个编码多囊蛋白 1氨基端的cDNA片段 (50 2bp和 471bp)。构建的表达质粒经酶切和DNA测序证实 ,为所需要的质粒。表达出相对分子质量 (Mr)分别为 1980 0和 1890 0的融合蛋白 ,经Westernblot鉴定 ,均为多囊蛋白 1的融合蛋白。用Mr 为 1890 0的融合蛋白免疫小鼠 ,得到杂交瘤细胞株 7B1。Westernblot分析表明 ,该细胞株分泌的mAb能特异地与多囊蛋白 1氨基端结合。结论 :本实验表达了PKD1多拷贝区所编码的PC1 e2 ,成功地制备了抗多囊蛋白 1胞外区N端的mAb。