rDNA介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用

根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增特定的2.2kbrDNA片段,并以此替换酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)整合载体YIp5的URA3片段;在此基础上,引入G418抗性基因KanMX和酵母磷酸甘油激酶(phosphoglyceratekinase,PGK)组成型强启动子和终止子序列(PGKpt),构建适合酿酒酵母工业菌株高拷贝整合表达载体pYMIKP.以细菌木糖异构酶(xyloseisomerase,XI)基因xylA为目标基因,通过载体pYMIKP引入到酵母工业菌株NAN27中.酵母转化子在非选择培养条件下,连续生长50世代质粒稳定性为99.72%.目标基因高拷贝重组菌的木糖异构酶比酶活是对照菌株的67.2倍,达到0.672Umg蛋白,实现了外源基因在酿酒酵母工业菌株中的稳定高效表达.

以rDNA为同源重组位点酵母表达鲑鱼降钙素基因多拷贝整合载体的构建

根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增2.2 kb rDNA片段,导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)整合载体pYD1中,设计并合成适合在酵母中表达的鲑鱼降钙素(Salmon Calcitonin),以此为目标基因,构建适合酿酒酵母多拷贝整合的表达载体p-r-sCT。通过载体p-r-sCT引入到酿酒酵母菌株EBY100中,得到酵母重组菌株yAGA2-r-sCT。流式细胞检测结果表明,目标基因鲑鱼降钙素在重组菌株的yAGA2-r-sCT中得到了表达,实现了外源基因在酿酒酵母菌株中的稳定表达。

巴斯德毕赤酵母多拷贝整合表达组装禽流感病毒样颗粒

【目的】构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础。【方法】以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒p8K-HA/M/NA。表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。【结果】PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M_(1)和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80~120 nm的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。【结论】重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒。

ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建

利用PCR技术,以酿酒酵母S288c的基因组DNA为模板,扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合成酶基因(ScINO1)包含1 602bp的开放读码框,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定,测序结果与GenBank上已登录的ScINO1序列完全一致.对PUG6载体进行改造,构建了rDNA介导的多拷贝整合表达载体pURH,并将ScINO1基因连入载体pURH,获得ScINO1基因超表达载体pURIH.为下一步的微生物发酵法产肌醇和获得能够耐高乙醇的酵母工程菌株的研究奠定基础.

lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合.首先构建一个携带lys1-d和EGFP(enhanced green fluorescent protein)报告基因的整合载体,然后将载体转化至敲除了内源lys1基因的毕赤酵母中,最后分别检测了转化子内EGFP含量和质粒拷贝数.结果显示,所有转化子整合的质粒拷贝数均处于19~168之间;并且转化子内质粒拷贝数越高,其胞内表达的EGFP产量也越高.这一系统为构建毕赤酵母超高拷贝质粒整合菌株增添了有效的工具.

基于CRISPR/Cas9和紫外诱变构建高产小牛胰凝乳酶的多拷贝乳酸克鲁维酵母

小牛胰凝乳酶(bovine chymosin)作为重要的食品酶,广泛应用于乳制品行业中奶酪的生产制造。本研究将密码子优化后的小牛胰凝乳酶酶原基因作为目的基因,构建了分泌表达框,通过基因组整合至乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis),单拷贝菌株的摇瓶发酵活力达到了40U/mL;基于单拷贝菌株,采用CRISPR/Cas9技术敲除筛选基因amdS,构建了多拷贝整合菌株,双拷贝和三拷贝整合菌株的摇瓶发酵活力分别增加到70U/mL和78U/mL。基于双拷贝整合菌株KLUcym^(D),采用紫外诱变育种技术,在多轮诱变育种后筛选得到一株高产小牛胰凝乳酶的重组菌株KLUcym^(D)-M2,摇瓶发酵酶活力达到270U/mL;5L罐中发酵76h,酶活力达到最高值600U/mL。综上,本研究成功构建了一株高产小牛胰凝乳酶的乳酸克鲁维酵母重组菌株,为进一步工业化放大生产奠定了基础。

短小芽孢杆菌C-9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C-9中克隆得到葡聚糖内切酶基因,该基因包含1980 bp核苷酸,编码559个氨基酸,其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列;以YIp5质粒为骨架,构建rDNA介导的多拷贝整合载体,实现葡聚糖内切酶在酿酒酵母中的高效、稳定表达。与对照菌株相比,含有葡聚糖内切酶基因的重组酿酒酵母可以在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基上生长。

解脂耶氏酵母异源合成番茄红素的初步研究

为了探究番茄红素在解脂耶氏酵母中的生物合成,利用两个解脂耶氏酵母整合表达质粒(单拷贝质粒pINA1269和多拷贝质粒pINA1312),将成团泛菌来源的番茄红素生物合成基因(crtE、crtB、crtI)克隆到解脂耶氏酵母营养缺陷型宿主菌Po1f中实现多基因共表达,并成功构建了异源合成番茄红素的解脂耶氏酵母工程菌株。在hp4d启动子和XPR2终止子的控制下,本实验共构建了8个能产番茄红素的解脂耶氏酵母工程菌株;同时筛选了其中5个代表性菌株(Po1f-1269IBE-1312、Po1f-1312E-1269IB、Po1f-1312B-1269IE、Po1f-1312I-1269EB、Po1f-1312IBE-1269)基于摇瓶培养进一步研究其生长特性和产物合成情况。结果表明,工程菌Po1f-1312E-1269IB的培养可以获得最高番茄红素产量,相对于细菌干重其产量约为0.9mg/g。

Impact of Copy Number on Transgene Expression In Tobacco

对农杆菌介导法获得的转 β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)烟草 (NicotianatabacumL .)进行GUS表达分析 ,发现部分转基因植株无GUS活性。进一步Southern杂交结果发现 ,GUS基因失活植株的基因组中整合了多个uidA拷贝 ,而GUS活性高的转基因植株多为uidA单拷贝整合 ,表明uidA基因失活与基因多拷贝整合有关。Northern杂交结果显示 ,失活植株无特异uidARNA杂交带 ,而GUS活性高的植株可检测到明显的杂交信号 ,说明多拷贝引起的基因失活发生在RNA水平。

酿酒酵母基因编辑技术研究进展

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是代谢工程中最重要的宿主之一,先进的基因编辑技术已经被广泛应用于酿酒酵母细胞工厂的设计和构建。随着基因编辑技术的飞速发展,早期基于重组酶和同源重组的基因编辑技术逐渐被新型基因编辑系统所替代。文中对酿酒酵母基因编辑技术的原理和应用进行了总结,包括经典的酿酒酵母基因编辑技术,基于核酸内切酶的MegNs、ZFNs和TALENs等基因组编辑系统,最后介绍和讨论了基于CRISPR/Cas系统、异源代谢途径多拷贝整合和基因组规模基因编辑的最新研究进展,并对酿酒酵母基因编辑技术的应用前景和发展方向进行了展望。