西藏墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体种型鉴定

目的鉴定西藏林芝地区墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体的种型。方法墨脱县捕获的5190只按蚊经形态学鉴定为多斑按蚊复合体后,随机取575只,酚-氯仿法提取单蚊DNA作为模板,根据伪威氏按蚊、多斑按蚊、威氏按蚊、达罗毗按蚊和塞沃按蚊分别设计5对特异性引物,PCR扩增rDNA第二转录间隔区(ITS2)片段,进行种型鉴别。对目标片段进行测序、同源性比对,并运用MEGA(3.1)软件构建多斑按蚊复合体的系统进化树。结果575份DNA样本中有11份扩增出约231bp的条带,即威氏按蚊(1.9%);564份扩增出约119bp的条带,为伪威氏按蚊(98.1%)。PCR种型鉴定结果与同源性比对及系统进化树的结果一致。结论西藏林芝地区墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体由伪威氏按蚊和威氏按蚊构成,伪威氏按蚊为优势蚊种。

我国多斑按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 建立我国多斑按蚊复合体5成员种的分子鉴别方法。 方法 测定并分析各成员种的rDNA-ITS2序列,并设计种特异引物,应用PCR法鉴别。结果 多斑按蚊复合体5成员种的ITS2序列长度和GC含量分别为伪威氏按蚊328 bp、58.54％、多斑按蚊330 bp、57.85％、威氏按蚊337 bp、59.05％、达罗毗按蚊334 bp、58.68％和塞沃按蚊338 bp、57.69％,各种内的ITS2序列保守,而种间的差异率范围为9.7％～18.9％。应用5.8S引物和5个种特异引物可以分别扩增出119、186、231、327和406 bp等5条清晰不同的种特异条带,以鉴别各蚊种。 结论 基于ITS2序列差异建立的我国多斑按蚊复合体5成员种的PCR鉴别简便易行、可靠。

应用PCR-SSCP鉴别我国多斑按蚊复合体成员种(双翅目:蚊科)

测定并分析了我国多斑按蚊复合体5个成员种(多斑按蚊、威氏按蚊、伪威氏按蚊、达罗毗按蚊和塞沃按蚊)核糖体DNA28S-D3序列,应用PCR-SSCP技术对该复合体成员种进行分子鉴别。结果显示:我国多斑按蚊复合体5个成员种的D3序列长度范围为388～394bp,GC含量为58.12%～59.79%,D3序列在种内保守,在种间存在差异,种间差异最大的是达罗毗按蚊与伪威氏按蚊为6.55%,最小的是达罗毗按蚊与多斑按蚊为2.58%,平均差异率为4.59%。用SSCP分析多斑按蚊复合体5个成员种的28S-D3扩增产物,结果显示电泳条带具种特异性,可用于鉴别各蚊种。

西藏墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变

目的探明西藏林芝地区疟疾流行区墨脱县多斑按蚊复合体是否发生击倒抗性突变,并获得我国多斑按蚊复合体5成员种钠离通道蛋白基因(VGSC)IIS4-S6区段基因序列信息。方法采用简并引物扩增我国多斑按蚊复合体5成员种的VGSC基因IIS4-S6区段,扩增产物双向测序拼接;PCR扩增墨脱县背崩乡、德兴乡、墨脱镇和达木乡捕获的共161只多斑按蚊复合体VGSC基因,对PCR产物双向测序,观察L1014位点是否发生突变。结果获得我国多斑按蚊复合体5成员种VGSC基因IIS4-S6区段基因序列,5成员种L1014位点均为TTA,对墨脱县的背崩乡、墨脱镇和达木乡捕获的伪威氏按蚊和威氏按蚊进行VGSC扩增并测序,均未发生击倒抗性突变。结论西藏林芝地区墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变。

我国多斑按蚊复合体mtDNA-COⅠ基因序列特征与系统发育学研究

目的测序并比较多斑按蚊复合体5成员种(伪威氏按蚊、多斑按蚊、威氏按蚊、达罗毗按蚊及塞沃按蚊)mtD-NA-COⅠ基因序列差异,并探讨其系统进化关系。方法多斑按蚊复合体经形态学和ITS2分子鉴定种型后,PCR扩增多斑按蚊复合体mtDNA-COⅠ基因序列,采用Chromas软件核对,必要时手动调整,采用Bioedit软件进行比对分析,采用Mega3.0软件构建系统进化树。结果 PCR扩增mtDNA-COⅠ基因序列全长约645～660bp,平均G+C含量为29.1%,A+T含量为70.9%。5种不同算法计算的5成员种成对种间距离有较小偏差,但种间遗传距离范围基本趋于一致,以塞沃按蚊、达罗毗按蚊及多斑按蚊亲缘关系最近,其后依次为威氏按蚊和伪威氏按蚊。结论根据mtDNA-COⅠ基因序列,采用不同方法构建的多斑按蚊复合体系统进化树结果基本一致,该基因序列适用于多斑按蚊复合体分析系统学分析。

巢氏PCR判定西藏疟疾流行区传疟媒介

目的确定西藏墨脱县疟疾流行区的疟疾传播媒介。方法根据2005、2006和2007年疟疾发病情况,在墨脱县选择了3个疟疾发病较高的自然村,采用人诱、牛诱、灯诱及清晨人房全捕等方法捕获成蚊,经形态学鉴定后麻醉处死,密封干燥,带回实验室-20℃冻存备用,采用混合样本法随机抽取10只多斑按蚊复合体为一份混合标本,提取蚊虫DNA。根据文献采用巢氏PCR扩增疟原虫小亚单位核糖体脱氧核糖核酸(SSUrDNA),并对阳性结果克隆测序,比对证实。结果共捕获按蚊5345只,其中多斑按蚊复合体5190只,带足按蚊155只,提取的360份多斑按蚊复合体混合样本DNA中发现子孢子阳性扩增样品2份,种型鉴定2份阳性混合样本均为伪威氏按蚊,PCR产物经克隆测序,NCBIBLAST同源性比对证实为疟原虫SSurDNA基因片段。结论多斑按蚊复合体中的伪威氏按蚊为西藏林芝疟疾流行区的传疟媒介。