用不同培养基生产猪多杀性巴氏杆菌活疫苗的试验研究

用马丁干粉和马丁肉汤培养基培养猪多杀性巴氏杆菌,分别生产3批猪多杀性巴氏杆菌活疫苗。结果用马丁干粉培养基生产的制苗用菌液的活菌数分别为1.80×1010CFU/mL、1.75×1010CFU/mL、1.80×1010CFU/mL;冻干后的存活率分别为64%、69%、67%。用马丁肉汤培养基生产的制苗用菌液的活菌数分别为1.20×1010CFU/mL、1.50×1010CFU/mL、1.10×1010CFU/mL,冻干后的存活率分别为50%、49%、54%。用两种培养基制备的疫苗按《兽用生物制品检验标准(》以下简称《标准》)检验6批疫苗均合格。

绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌的生物学特性及2种候选疫苗的免疫效果评价

旨在研究新疆绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌(PmD)的生物学特性,探索其灭活疫苗与OmpH重组疫苗对小鼠的免疫保护效果,为防控新疆地区绵羊巴氏杆菌病提供参考。采用细菌分离鉴定、PCR鉴定、药敏试验、耐药与毒力基因检测、致病性试验等方法初步明确PmD的生物学特性;并通过最佳灭活条件和佐剂筛选、安全性试验、原核表达等方法制备PmD灭活疫苗与PmD-OmpH重组疫苗,采取小鼠攻毒保护试验评价2种疫苗的免疫效力。结果:从绵羊肺脏中分离出1株PmD,药敏试验显示,该菌为7重耐药菌,未检测到耐药基因;毒力基因检测显示,该菌具有12种毒力基因(exbB、exbD、hgbA、tonB、fimA、Oma87、OmpH、Psl、sodA、sodC、tbpA、toxA);致病性较强,对小鼠的最小致死菌量为2.2×105 CFU;灭活疫苗和重组疫苗对相同血清型菌株攻毒的保护率分别为80%和10%;灭活疫苗对血清型A、F和未知菌株攻毒保护率分别为0、20%和0,而重组疫苗的保护率则全为0。本研究发现1株强耐药、强毒力的绵羊源PmD,灭活疫苗对同种血清型菌株的保护性远高于重组疫苗,发病地区羊场可采用同种血清型灭活疫苗进行预防和控制绵羊巴氏杆菌病,对多价疫苗和新型疫苗的研制还有待进一步发掘。

牛多杀性巴氏杆菌病疫苗效力检验用攻毒菌的研究

为提高我国牛多杀性巴氏杆菌病疫苗效力评价方法的稳定性、可靠性及检验效率,研究制备了活菌数定量的攻毒用牛多杀性巴氏杆菌C45-2株的冻干菌。对其性状、纯粹、真空度、剩余水分、均一性、活菌数稳定性及毒力稳定性进行了检验和评价。冻干攻毒菌在疫苗效力检验中进行应用,并与-70℃冻存的攻毒菌液进行了比较研究。结果表明,定量冻干菌的性状、纯粹、真空度和剩余水分均符合冻干制品的要求;均一性检查变异系数与低温冻存菌液变异系数均小于6%,均一性良好;保存15个月活菌数稳定性良好,较冻存菌液有明显的优势;保存12个月内毒力略有下降,但不影响疫苗的效力检验,可有效评价疫苗质量。试验表明冻干菌株能满足牛多杀性巴氏杆菌效力检验使用,且简化了细菌培养步骤,提高了检验结果的稳定性和工作效率。

多杀性巴氏杆菌的分型及其灭活疫苗研究进展

巴氏杆菌病（Pasteurellosis）是由多杀性巴氏杆菌（Pas—teurellamultocida，Pm）引起的多种畜禽、野生动物及人类的一类传染病的总称。动物急性病例以败血症和炎性出血为主要特征。Pm由路易斯-巴斯德于1880年首次从禽霍乱病例中分离获得并以其名字命名。该菌广泛分布于世界各地。在同种或不同种动物问可以相互传染，也可以感染人，大多因动物咬伤所致。蝉和蚤被认为是自然传递的媒介昆虫。过去曾按感染动物的名称，

多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数参考品的研究

为了研制多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数的参考品,以期更科学的评价活菌计数结果的有效性。制备一批猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗为参考品候选物,对其性状、纯粹、真空度、剩余水分进行检测,对其运输稳定性、均一性进行测定,组织协作标定对参考品候选物进行定值,用协作标定的方法统计参考品候选物24个月的保存期,将参考品应用于多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数的检验。结果表明,参考品的性状、纯粹检验、剩余水分和真空度测定均符合《中国兽药典》的规定,均一性试验结果显示,10瓶参考品候选物计数结果的变异系数为5.4%,小于10%,说明其均一性良好。协作标定的赋值范围为(4.2~5.6)×10^8 CFU/头份,保存期试验结果显示,参考品候选物在-70℃以下保存24个月菌数稳定。参考品的初步应用显示本参考品不仅可以为多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数提供参照物,而且可以用于控制多杀性巴氏杆菌类疫苗检验用马丁琼脂培养基的质量。

牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗的研究

为了防控A型多杀性巴氏杆菌(Pm)引起的牛纤维素性化脓性肺炎以及B型Pm引起的牛出血性败血症,本研究制备了牛Pm病二价灭活疫苗(A型Pm-TJ株+B型C45-2株),并将疫苗分别以0.3 m L和4 m L接种小鼠和兔后,所有接种动物均健活;分别以单剂量(2 m L)、单剂量重复、超剂量(4 m L)接种肉牛和奶牛后,接种牛均无不良反应,而且接种疫苗对肉牛增重和奶牛产奶量均无影响,表明疫苗安全性良好。以不同的免疫剂量接种牛后,分别采用A型和B型Pm强毒菌液对免疫牛进行攻击,结果显示,疫苗能够对攻毒牛产生良好的免疫保护,并且疫苗的免疫效力呈现剂量依赖性,最小免疫剂量为1 m L (对A、B型Pm攻毒牛的保护率分别达到75%与100%)。此外,犊牛接种疫苗10个月后攻毒,对A、B型菌攻毒牛的保护率仍分别能够达到75%与100%,表明该疫苗的免疫持续期至少可达10个月。综上所述,该牛Pm二价灭活疫苗能够有效预防牛纤维素性化脓性肺炎和牛出血性败血症,该疫苗的推广应用将对我国牛Pm病的防控发挥关键性作用。

青藏高原牦牛多杀性巴氏杆菌灭活疫苗免疫效果研究

为了解决青海省牦牛出血性败血症灭活疫苗出现的免疫失败问题,筛选具有良好免疫原性并适合当地牛群免疫的疫苗型,试验通过对多杀性巴氏杆菌疫苗株和野生分离株进行了活化培养、活菌计数、疫苗的制备、毒性试验及攻毒保护试验。结果表明:疫苗株的毒性要强于野生分离株的毒性,但是野生分离株在TSB液体培养基上的增菌速度要强于疫苗株的速度;野生分离株灭活疫苗的保护效果较好,保护率为90%,高于疫苗株灭活疫苗(保护率为70%)。

兔病毒性出血症与多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的试制和效果

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗于江苏省农业科学院兽医研究所畜禽生物制品研究开发中心试制 5批 ,计 10 0余万头份。疫苗效力试验对兔病毒性出血症总保护率为 10 0 %;对兔多杀性巴氏杆菌病总保护率为 95 %。疫苗于苏、鲁、皖、浙、沪、晋、闽、津等省、市养兔单位应用 ,据反馈信息表明 ,疫苗安全、有效。确认本疫苗的生产工艺成熟、可行 ,可进行工厂化生产。所生产的二联苗能有效预防该两病的发生。

禽多杀性巴氏杆菌、H9亚型禽流感二联灭活疫苗研制及免疫效力试验

采用鸡胚共同增殖禽多杀性巴氏杆菌和H9亚型禽流感病毒的方法制备的抗原中含巴氏杆菌数≥4×1010CFU/mL、H9亚型禽流感病毒含量≥109.38EID50/mL,经灭活后制备3批二联灭活疫苗并进行了相关检验。结果表明,所研制的3批二联疫苗的物理性状、无菌检验以及安全检验均符合相关质量标准;用3批疫苗分别免疫试验鸡和试验鸭,21 d后对禽多杀性巴氏杆菌免疫保护率均为90%以上,对H9亚型禽流感免疫保护率均为85%以上。

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A)型三联灭活疫苗研制

对 5批兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病三联灭活疫苗进行了动物试验 ,结果表明该疫苗安全有效。近期效检对兔病毒性出血症的保护率为 1 0 0 % ,对兔多杀性巴氏杆菌病保护率为 92 % ,对产气荚膜梭菌病 (A)型保护率为 88%。在免疫期试验中 ,免疫 6个月后 ,对兔病毒性出血症保护率为 1 0 0 % ,对多杀性巴氏杆菌病的保护率为 79% ,对产气荚膜梭菌病 (A)型的保护率为 88%。在保存期试验中 ,4～ 8℃保存 1年仍有效。

兔病毒性出血症与多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗生产菌种保存期试验

对冻干后-20℃保存3年以上的兔出血症病毒皖阜株、兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C51-17冻干菌种按《中华人民共和国兽用生物制品规程》有关规定进行了冻干毒、菌种存活情况检查和全面系统鉴定。结果表明兔出血症病毒皖阜株3株冻干毒种在-20℃保存3年,血凝性、特异性、最小致死量、免疫原性符合规程要求。兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C51-17冻干菌种在-20℃保存10年,菌体形态、菌落特征、生化特性、血清学特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定标准。

多杀性巴氏杆菌流行病学及其疫苗研究进展

多杀性巴氏杆菌分属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属,可致牛出血性败血症、猪萎缩性鼻炎、禽霍乱等多种动物疾病,严重危害畜牧业发展。本文阐述多杀性巴氏杆菌的病原学、流行病学特征、国内流行状况以及疫苗研究进展,从而为该细菌病的治疗和研究提供参考。

河西走廊牛源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的制备及临床效果检测观察

根据牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的培养特性,本研究采用脑心浸液肉汤（BHI）培养基静止培养24 h,每2h震荡一次的方法进行培养,将培养的A型多杀性巴氏杆菌灭活后制成A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗,免疫小白鼠和日本大耳白家兔.结果显示：A型灭活苗的保护率为100％;将制备的灭活疫苗进行肉牛安全性试验,均未发现过敏反应等异常情况;在河西走廊嘉峪关、酒泉、张掖、金昌和武威5市应用对网牛春（2～3月）、秋（10～11月）两季分别免疫注射制备的A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗,剂量为体重100 kg以上6 mL/头,100 kg以下4 mL/头的方法进行了较大规模的临床效果观察,免疫牛均未发现不良反应,实验组牛巴氏杆菌病发病、死亡率分别分别比对照组低2.4、1.99个百分点,差异极显著（p＜0.01）.

黄芩苷对多杀性巴氏杆菌感染猪巨噬细胞后炎症因子表达及信号通路影响的研究

为研究不同浓度黄芩苷对多杀性巴氏杆菌(Pm)HN-13株感染的猪巨噬细胞(HD11)内炎症因子表达的影响及与炎症信号通路的相互作用关系,本研究采用western blot检测HN-13株感染(0、30 min、60 min、90 min)HD11细胞中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路3个关键蛋白(p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK)的表达水平;采用ELISA和荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)分析检测低浓度剂量黄芩苷(L组,20μmol/L)、中浓度剂量黄芩苷(M组,40μmol/L)和高浓度剂量黄芩苷(H组,60μmol/L)对Pm感染的猪巨噬细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β分泌水平及其m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)和模型组(HN-13);利用抑制剂SCH772984阻断ERK通路,采用ELISA和RT-qPCR检测黄岑苷对Pm感染的HD11细胞内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达及m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)、模型组(HN-13)、抑制组(HN-13+抑制剂)。结果显示:与HN-13株处理0 min组相比,随着感染时间的延长,HN-13株感染HD11细胞中p-ERK/ERK的蛋白表达量逐渐升高(P<0.01),而p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达量均未发生显著变化(P>0.05),表明,HN-13株可使HD11细胞炎症相关ERK通路蛋白表达增强,且与作用时间呈正相关。与模型组(HN-13)相比,3个浓度剂量的黄芩苷均显著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平及m RNA转录水平(P<0.05),且抑制作用随着黄芩苷浓度升高而增强。与抑制组相比,黄芩苷与抑制剂共处理组可以显著抑制HN-13感染的HD11细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及m RNA转录水平(P<0.05)。综上所述,黄芩苷可以抑制Pm感染的HD11细胞中ERK通路相关蛋白的表达和分泌,进而发挥抗炎作用。本研究为研制防治Pm引起的猪肺疫的新药提供了思路。

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)三联浓缩灭活疫苗的研制

通过对抗原的浓缩 ,试制成功兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病 (A型 )三联氢氧化铝浓缩灭活疫苗。将该三联疫苗按每只 1ml的剂量免疫家兔 ,2 1d后效力试验结果表明 ,对兔病毒性出血症的保护率为 10 0 % ;对兔巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病 (A型 )的保护率均达 80 %以上 ,且对上述 3种病的免疫期为 180～2 10d(即 6～ 7个月 )。该疫苗 4～ 8℃保存 15 0d(5个月 )

两株兔源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及荚膜血清分型

为探明浙江省规模兔场主要传染病流行现状,明确其致病菌及血清型,开展了家兔流行病学调查与病原分离鉴定。调研发现,不少兔场存在以打喷嚏和鼻腔流出浆液性、黏液性或脓性分泌物为主要临床特征的呼吸道传染病,进而对浙江省家兔主产区发病严重兔场进行采样,从嵊州、宁波三家患病兔鼻腔中分离到两株病原菌,进行了病原分离鉴定、荚膜血清分型及药敏试验。根据分离菌的菌落形态、革兰氏染色特征、特异性PCR以及荚膜血清分型PCR鉴定结果,确定两株致病菌均为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌,分别命名为ZJNB0321和ZJSZ0322。构建系统发育树,结果表明,两分离株属于同一分支,且与多杀性巴氏杆菌处于同一分支,并拥有独立的分支。药敏试验结果表明,不同地区分离株药敏特性不尽相同。研究结果为兔场合理用药及有效防控提供了科学依据。

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对小鼠的保护性研究

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌是导致牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease,BRD)的重要细菌性病原,每年给养牛业带来巨大的经济损失,目前对其疫苗研究仍显不足。本研究选用牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)Mh422株和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)PmCQ2株作为疫苗菌株,分别制备了2种菌体浓度的Mh和Pm单价灭活菌苗及3种菌量配比(1∶1、2∶1和3∶1)的Mh-Pm二联灭活苗,以小鼠为模型,皮下多点免疫(0.2 mL),加强免疫2次,免疫剂量均为首免的一半。首免后第7天及其后每隔5 d,小鼠尾静脉采血分离血清,ELISA方法检测抗体效价,三免后第20天,分别以Mh422或PmCQ2进行腹腔攻毒测定免疫保护效果。结果显示,所有小鼠接种疫苗均无不良反应,二免后第10天抗体达较高水平,三免后抗体水平持续升高,第15天到达高峰,其后25 d维持高水平,后缓慢下降。Mh单菌苗的2种免疫剂量对Mh422株攻毒的免疫保护率均为0,而Pm单菌苗的2种免疫剂量对PmCQ2株攻毒的免疫保护率全为100%;Mh和Pm间无交叉免疫保护作用;3种菌量配比的Mh-Pm二联疫苗对Mh422株和PmCQ2株攻毒的各自免疫保护率分别为53%~71%和100%。该研究结果表明,所制备的Mh422单菌苗对同型攻毒无免疫保护作用,在诱导机体抗体产生方面,Mh和Pm间无相互抑制作用,PmCQ2株具有促进Mh422株灭活疫苗对Mh422的免疫保护作用,这为牛溶血性曼氏杆菌和牛多杀性巴氏杆菌二联疫苗的进一步研究提供了理论基础。

江苏省肉种鸡场禽多杀性巴氏杆菌流行病学调查

为了解江苏省禽多杀性巴氏杆菌流行情况,促进肉种鸡场的禽多杀性巴氏杆菌病防控,研究通过细菌鉴定方法、PCR检测、荚膜血清学分型、致病性分析以及药物敏感性试验,对分离自江苏省17个肉种鸡场的禽多杀性巴氏杆菌进行菌落形态、培养特性、生化发酵、荚膜型、菌落荧光型、药敏性等生物学特性研究,并对部分种鸡场进行血清学检测。结果显示:共鉴定13株禽多杀性巴氏杆菌,所有分离株荚膜分型均为A型,菌落荧光观察均属于强毒株;分离株对氨基糖苷类药物和氯霉素类药物具有一定的耐药性,而对β-内酰胺类药物高度敏感;确诊种鸡场阳性率显著高于未确诊种鸡场(P<0.01)。研究表明,江苏省部分地区肉种鸡场存在荚膜A型多杀性巴氏杆菌流行,强毒株比例较高,但耐药性较弱。

鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

目的:从疑似禽霍乱的4只病死鸭的病料中分离并鉴定多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),并通过药敏试验筛选敏感药物用于治疗。方法:无菌采集肝脏组织病料,接种至普通营养琼脂、麦康凯及血琼脂培养基上进行病原菌的培养、分离纯化;对纯化后的分离菌进行革兰染色、镜检,提取其核酸作为模板,进行16S rRNA基因的PCR鉴定;圆纸片扩散试验测定分离菌株对18种抗菌药物的敏感程度。结果:在血琼脂培养基上分离菌株表现为稍微隆起、表面光滑、湿润、灰白色、露珠样、半透明的圆形菌落,但在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不生长。革兰染色镜检显示分离菌为一种革兰染色阴性、菌体两端着色深、中间着色较浅的球状短小杆菌。PCR扩增16S rRNA出现1 500 bp的目的条带,其序列分析与Pm菌株Q的16S rRNA基因的相似性为99.86%;药敏试验表明,分离菌株对米诺环素敏感性最高,抑菌圈直径达19 mm,对四环素、强力霉素、庆大霉素、氨苄西林、头孢哌酮表现中度敏感,其他药物均为耐药。结论:本研究从一例疑似禽霍乱的病死鸭中分离鉴定出1株多杀性巴氏杆菌,分离菌株对米诺环素较为敏感,建议用于临床治疗。