牛溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌A型、B型的比较鉴定研究

本研究旨在比较牛溶血性曼氏杆菌（M.haemolytica）和牛多杀性巴氏杆菌（P.multocida）A型、B型生理生化特性和PCR鉴定方法,为临床上述三种细菌的分离鉴定提供指导。培养牛溶血性曼氏杆菌、牛多杀性巴氏杆菌A型、B型菌,分别开展革兰氏染色镜检、生化鉴定、生长曲线测定、致病性检测和PCR鉴定。P.multocida A型、B型血平板培养基上P.multocida不溶血、M.haemolytica溶血,在麦康凯培养基上P.multocida不生长、M.haemolytica生长良好;三株细菌在生化特性方面基本相同,但P.multocida能形成靛基质、不发酵肝糖和肌醇,M.haemolytica不能形成靛基质、可分解肝糖和肌醇。三株细菌生长趋势大致相同,均于2～4h进入稳定期,18～20h开始衰退。小鼠感染低至5个P.multocida A型、B型菌可致死,M.haemolytica原液仍不能致死小鼠。所设计各菌株PCR引物能快速鉴定P.multocida A型、B型和M.haemolytica。P.multocida A型、B型和M.haemolytica在部分培养特性、生理生化特征、致病力及PCR鉴定方面存在显著差异。

绵羊多杀性巴氏杆菌A型、F型与溶血性曼氏杆菌A2型混合感染的诊断与防治

新疆某羊场的绵羊出现发热咳嗽、精神萎靡、食欲减退、嗜睡和呼吸困难等症状。经剖检和细菌分离鉴定、PCR鉴定、药敏实验和小鼠致病性试验等方法,分离到了3株革兰氏阴性球杆菌,根据形状和大小判断疑似多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌;PCR鉴定方法有效扩增出1100 bp、875 bp和900 bp,3条目的条带,经测序与GenBank数据库中同源序列比对,3株菌分别为多杀性巴氏杆菌A型、F型和溶血性曼氏杆菌A2型;药敏试验显示,3株细菌的混合液对左旋氧氟沙星、乳酸环丙沙星敏感;小鼠致病性试验中,小鼠在18 h内陆续死亡,表明巴氏杆菌和曼氏杆菌毒力强。诊断结果为羊巴氏杆菌及曼氏杆菌感染的诊断和治疗提供参考。

黄芩苷对多杀性巴氏杆菌感染猪巨噬细胞后炎症因子表达及信号通路影响的研究

为研究不同浓度黄芩苷对多杀性巴氏杆菌(Pm)HN-13株感染的猪巨噬细胞(HD11)内炎症因子表达的影响及与炎症信号通路的相互作用关系,本研究采用western blot检测HN-13株感染(0、30 min、60 min、90 min)HD11细胞中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路3个关键蛋白(p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK)的表达水平;采用ELISA和荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)分析检测低浓度剂量黄芩苷(L组,20μmol/L)、中浓度剂量黄芩苷(M组,40μmol/L)和高浓度剂量黄芩苷(H组,60μmol/L)对Pm感染的猪巨噬细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β分泌水平及其m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)和模型组(HN-13);利用抑制剂SCH772984阻断ERK通路,采用ELISA和RT-qPCR检测黄岑苷对Pm感染的HD11细胞内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达及m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)、模型组(HN-13)、抑制组(HN-13+抑制剂)。结果显示:与HN-13株处理0 min组相比,随着感染时间的延长,HN-13株感染HD11细胞中p-ERK/ERK的蛋白表达量逐渐升高(P<0.01),而p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达量均未发生显著变化(P>0.05),表明,HN-13株可使HD11细胞炎症相关ERK通路蛋白表达增强,且与作用时间呈正相关。与模型组(HN-13)相比,3个浓度剂量的黄芩苷均显著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平及m RNA转录水平(P<0.05),且抑制作用随着黄芩苷浓度升高而增强。与抑制组相比,黄芩苷与抑制剂共处理组可以显著抑制HN-13感染的HD11细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及m RNA转录水平(P<0.05)。综上所述,黄芩苷可以抑制Pm感染的HD11细胞中ERK通路相关蛋白的表达和分泌,进而发挥抗炎作用。本研究为研制防治Pm引起的猪肺疫的新药提供了思路。

江苏省肉种鸡场禽多杀性巴氏杆菌流行病学调查

为了解江苏省禽多杀性巴氏杆菌流行情况,促进肉种鸡场的禽多杀性巴氏杆菌病防控,研究通过细菌鉴定方法、PCR检测、荚膜血清学分型、致病性分析以及药物敏感性试验,对分离自江苏省17个肉种鸡场的禽多杀性巴氏杆菌进行菌落形态、培养特性、生化发酵、荚膜型、菌落荧光型、药敏性等生物学特性研究,并对部分种鸡场进行血清学检测。结果显示:共鉴定13株禽多杀性巴氏杆菌,所有分离株荚膜分型均为A型,菌落荧光观察均属于强毒株;分离株对氨基糖苷类药物和氯霉素类药物具有一定的耐药性,而对β-内酰胺类药物高度敏感;确诊种鸡场阳性率显著高于未确诊种鸡场(P<0.01)。研究表明,江苏省部分地区肉种鸡场存在荚膜A型多杀性巴氏杆菌流行,强毒株比例较高,但耐药性较弱。

两株兔源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及荚膜血清分型

为探明浙江省规模兔场主要传染病流行现状,明确其致病菌及血清型,开展了家兔流行病学调查与病原分离鉴定。调研发现,不少兔场存在以打喷嚏和鼻腔流出浆液性、黏液性或脓性分泌物为主要临床特征的呼吸道传染病,进而对浙江省家兔主产区发病严重兔场进行采样,从嵊州、宁波三家患病兔鼻腔中分离到两株病原菌,进行了病原分离鉴定、荚膜血清分型及药敏试验。根据分离菌的菌落形态、革兰氏染色特征、特异性PCR以及荚膜血清分型PCR鉴定结果,确定两株致病菌均为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌,分别命名为ZJNB0321和ZJSZ0322。构建系统发育树,结果表明,两分离株属于同一分支,且与多杀性巴氏杆菌处于同一分支,并拥有独立的分支。药敏试验结果表明,不同地区分离株药敏特性不尽相同。研究结果为兔场合理用药及有效防控提供了科学依据。

鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

目的:从疑似禽霍乱的4只病死鸭的病料中分离并鉴定多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),并通过药敏试验筛选敏感药物用于治疗。方法:无菌采集肝脏组织病料,接种至普通营养琼脂、麦康凯及血琼脂培养基上进行病原菌的培养、分离纯化;对纯化后的分离菌进行革兰染色、镜检,提取其核酸作为模板,进行16S rRNA基因的PCR鉴定;圆纸片扩散试验测定分离菌株对18种抗菌药物的敏感程度。结果:在血琼脂培养基上分离菌株表现为稍微隆起、表面光滑、湿润、灰白色、露珠样、半透明的圆形菌落,但在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不生长。革兰染色镜检显示分离菌为一种革兰染色阴性、菌体两端着色深、中间着色较浅的球状短小杆菌。PCR扩增16S rRNA出现1 500 bp的目的条带,其序列分析与Pm菌株Q的16S rRNA基因的相似性为99.86%;药敏试验表明,分离菌株对米诺环素敏感性最高,抑菌圈直径达19 mm,对四环素、强力霉素、庆大霉素、氨苄西林、头孢哌酮表现中度敏感,其他药物均为耐药。结论:本研究从一例疑似禽霍乱的病死鸭中分离鉴定出1株多杀性巴氏杆菌,分离菌株对米诺环素较为敏感,建议用于临床治疗。

1株牛源D:L3:L5型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及病原特性评价

【目的】通过探讨青海省西宁市某规模化奶牛场病死牛源多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型、耐药性和毒力基因分布情况,为多杀性巴氏杆菌引起的牛呼吸道疾病的治疗和预防提供参考。【方法】对病死牛肺脏样本进行细菌分离,通过菌落观察和染色镜检、生化鉴定、特异性引物扩增、16S rRNA测序分析及系统发育树构建、荚膜血清及脂多糖分型、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验对分离菌进行鉴定和病原特性评价。【结果】肺脏样本中分离得到的菌落呈现灰白色中间微凹陷的露珠样,未出现溶血环;革兰染色可见粉红色球杆菌;瑞氏染色可见两端浓染的蓝色球杆菌。生化鉴定结果显示,分离菌株D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、酪氨酸芳胺酶、磷酸酶、COURMARATE和ELLMAN反应结果为阳性;16S rRNA测序结果显示,分离菌株与多种多杀性巴氏杆菌相似性>95%,鉴定分离得到的菌株为多杀性巴氏杆菌,命名为XN222。荚膜血清分型及脂多糖分型结果显示,分离菌株XN222的荚膜血清分型为D型,其脂多糖分型为L3和L5型。毒力基因扩增结果显示,分离菌株XN222携带ptfA、fimA、hsf-2、sodA、tbpA、sodC等共计19种毒力基因。小鼠致病性试验结果显示,注射0.2 mL 1.5×10^(8)CFU/mL菌液,可导致100%(10/10)小鼠死亡,说明分离菌株XN222具有较强的致病能力。药敏试验结果显示,分离菌株XN222对头孢噻呋、左氧氟沙星、恩诺沙星、马波杀星、四环素和青霉素等15种抗菌药均敏感,对泰乐菌素中度敏感。【结论】本研究分离获得1株致病力较强的D型多杀性巴氏杆菌,该菌株的发现丰富了国内牛源多杀性巴氏杆菌亚型,可为多杀性巴氏杆菌引起的牛呼吸道疾病的防治、病原学调查和巴氏杆菌多价苗研制等提供生物素材。

多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和全基因组测序分析

多杀性巴氏杆菌(Pm)可感染多种动物,引起肺炎或全身性败血症,造成严重的经济损失。为鉴定河北昌黎县某肉牛养殖场导致牛大批病死的病原,本研究从病牛肺脏中分离到疑似Pm的菌株,对其进行革兰氏染色观察,16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析,并对其荚膜和脂多糖进行PCR分型,PCR扩增其7个管家基因后分析分离菌的多位点序列分型(MLST)。结果显示,分离株为革兰氏阴性菌,与Pm的16S rDNA基因序列同源性达99.87%,表明分离到一株Pm。PCR分型鉴定结果显示其为血清B型和脂多糖L2型,MLST分型为ST44型,将该Pm分离株命名为PmB-1。将PmB-1以4.88 cfu/只经腹腔注射感染小鼠,进行致病性试验,结果显示PmB-1能引起小鼠内脏出血病变。采用IlluminaHiseq二代结合PacBio三代测序平台对PmB-1进行全基因组测序及生物信息学分析。结果显示,PmB-1基因组含1条染色质,长2 331 836 bp,编码2 141个基因,并含19个rRNA,58个tRNA和42个sRNA;含有3个前噬菌体、5个基因组岛,5个获得性免疫(CRISPR-Cas)系统、3个插入序列以及1个转座子元件。致病性预测分析结果显示,PmB-1含244个毒力相关基因,224个耐药基因,495个基因参与病原与宿主的互作,14个基因编码分泌系统蛋白,535个基因编码转运蛋白,190个基因编码分泌蛋白,499个基因编码跨膜蛋白,17个基因编码双组分调控系统。本研究分离到一株Pm,并对其进行小鼠致病性试验,全基因组测序和生物信息学分析,为预防Pm的感染、流行和研究其致病机制提供了参考依据。

绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌的生物学特性及2种候选疫苗的免疫效果评价

旨在研究新疆绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌(PmD)的生物学特性,探索其灭活疫苗与OmpH重组疫苗对小鼠的免疫保护效果,为防控新疆地区绵羊巴氏杆菌病提供参考。采用细菌分离鉴定、PCR鉴定、药敏试验、耐药与毒力基因检测、致病性试验等方法初步明确PmD的生物学特性;并通过最佳灭活条件和佐剂筛选、安全性试验、原核表达等方法制备PmD灭活疫苗与PmD-OmpH重组疫苗,采取小鼠攻毒保护试验评价2种疫苗的免疫效力。结果:从绵羊肺脏中分离出1株PmD,药敏试验显示,该菌为7重耐药菌,未检测到耐药基因;毒力基因检测显示,该菌具有12种毒力基因(exbB、exbD、hgbA、tonB、fimA、Oma87、OmpH、Psl、sodA、sodC、tbpA、toxA);致病性较强,对小鼠的最小致死菌量为2.2×105 CFU;灭活疫苗和重组疫苗对相同血清型菌株攻毒的保护率分别为80%和10%;灭活疫苗对血清型A、F和未知菌株攻毒保护率分别为0、20%和0,而重组疫苗的保护率则全为0。本研究发现1株强耐药、强毒力的绵羊源PmD,灭活疫苗对同种血清型菌株的保护性远高于重组疫苗,发病地区羊场可采用同种血清型灭活疫苗进行预防和控制绵羊巴氏杆菌病,对多价疫苗和新型疫苗的研制还有待进一步发掘。

广东鹅源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、耐药表型和耐药基因的检测及相关性分析

为了解广东地区鹅源多杀性巴氏杆菌(Pm)的流行情况、药物敏感性、耐药基因的携带情况以及耐药表型与耐药基因的相关性,本实验对2019年~2022年从广东地区采集的193份疑似感染Pm病鹅的心脏血液和肝脏组织划线接种于不同的培养基分离细菌,对分离菌纯化后采用PCR扩增分离菌的KMT1基因并测序,采用多重PCR扩增分离菌的5个荚膜基因及8个脂多糖基因,分析分离菌的荚膜分型与脂多糖(LPS)分型。结果显示分离到83株鹅源Pm,其中82株为荚膜A型,1株无法通过荚膜定型;LPS分型为L1型。采用K-B纸片扩散法检测分离菌的药物敏感性;通过PCR检测分离菌7类药物的15种耐药基因,包括β-内酰胺类(bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、bla_(OXA))、氨基糖苷类(aadA1、aph(3’)Ila)、喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrS)、酰胺醇类(floR)、四环素类(tetM、tetX)、大环内酯类(ermF、ereD)、磺胺类(sul1、sul3)耐药基因。采用统计学软件SPSS22中的完全随机设计两样本率的卡方检验分析分离菌的耐药表型和相应耐药基因的相关性。药敏试验结果显示,83株鹅源Pm对多种药物敏感性较高,其中对喹诺酮类的环丙沙星和氧氟沙星、氨基糖苷类的丁胺卡那和大观霉素、β-内酰胺类的头孢曲松、磺胺类的复方新诺明、大环内酯类的阿奇霉素敏感的菌株占比均在63%以上;对氨基糖苷类的链霉素和卡那霉素耐药的菌株占比高于50%,对氨基糖苷类的新霉素和四环素类的四环素耐药的菌株分别占49.40%(41/83)和46.99%(39/83)。耐药基因的检测结果显示,分离菌检出耐药基因qnrB、sul3、blaTEM、aadA1、aph(3’)Ila、ereD、ermF、tetM、floR,检出率分别为9.63%(8/94)、27.71%(23/83)、28.92%(24/83)、48.19%(40/83)、14.46%(12/83)、49.40%(41/83)、3.61%(3/83)、1.20%(1/83)、32.53%(27/83),未检出耐药基因qnrA、qnrS、sul1、tetX、bla_(CTX-M)、bla_(OXA)。相关性分析结果显示,aadA1基因与Pm对新霉素、链霉素、卡那霉素、大观霉素的耐药性具有极显著的相关性(P<0.001);bla_(CTX-M)基因、floR基因分别与Pm对头孢拉定、氟苯尼考的耐药性具有显著相关性(P<0.05)。上述结果表明,广东地区鹅源Pm主要为A∶L1基因型,对多种药物敏感,耐药基因携带率不高,部分药物的耐药表型与耐药基因具有相关性。本研究为广东地区鹅源Pm病的监测和防治提供参考依据,为Pm耐药机制的研究奠定基础。

西藏那曲市牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及基因组分析

旨在对引起西藏牦牛呼吸道感染的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定,明确病原菌的血清型、耐药性和致病性等生物学特性及基因组特征和遗传进化关系。本研究从西藏林芝、拉萨、那曲地区采集牦牛鼻咽拭子和组织病料498份,进行流行病学调查、细菌学分离纯化、生化试验、PCR鉴定、K-B药敏试验、动物致病性试验和分离株全基因组测序,并通过Mauve软件和MEGA 7软件进行基因共线性和系统进化分析。结果显示,经细菌分离纯化、生化试验及PCR鉴定,发现在西藏林芝、拉萨、那曲地区巴氏杆菌阳性率为2.61%,且从病死牦牛肺组织中分离出B型多杀性巴氏杆菌菌株,命名为“Pm XZ01”株;药敏试验发现Pm XZ01株对头孢菌素类、喹诺酮类、羧苄西林、丁胺卡那、复方新诺明和氯霉素类抗生素敏感;动物试验发现感染Pm XZ01株的家兔(1.2×10^(8) CFU·mL^(-1))和小鼠(1×10^(7) CFU·mL^(-1))死亡率高达100%,说明在该浓度下Pm XZ01株具有较强的致病性和致死性。全基因组测序获得Pm XZ01株全基因组大小为2331787 bp,GC含量为40.47%,重复序列总长度为3266 bp;含有121个非编码RNA基因,包括59个tRNA基因,19个rRNA基因,43个ncRNA基因;2个假基因,5个基因岛,3个前噬菌体,68个碳水化合物活性酶基因;CARD注释分析发现1个PBP3抗性基因和2个EF-Tu抗性基因;VFDB和PHI-base注释分析发现101个毒力因子相关基因及663个表型突变基因等;共线性分析发现Pm XZ01株与猪源HB03株(CP003328.1)、HN07株(CP007040.1)和禽源P1702株(CP097616.1)共线性最好,而与牦牛源Tibet-Pm1株(CP072655.1)共线性较差;系统进化树分析发现Pm XZ01株与中国广东牛源GDZQ201401株(KP083466.1)属于同一分支,进化关系最近。本研究完成了西藏牦牛巴氏杆菌病的流行病学调查,以及牦牛源B性多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、生物学特性和全基因组测序分析,为探索西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌病的流行规律和致病机制以及防控提供了参考。

多杀性巴氏杆菌的摄铁机制研究进展

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物,引起出血性败血症或传染性肺炎。铁是多杀性巴氏杆菌感染宿主过程中生长、定植和增殖必不可少的营养物质,竞争宿主铁离子是该病原体感染致病的关键环节。近年来,多杀性巴氏杆菌的摄铁系统及其发生与调控机制方面的研究取得了一系列重要进展。本文系统阐述了多杀性巴氏杆菌的转铁蛋白受体摄铁机制、血红素受体摄铁机制、铁载体摄铁机制及其摄铁系统的表达与调控机制,以期为多杀性巴氏杆菌摄铁系统的分子致病机理研究提供系统的理论知识,为多杀性巴氏杆菌分子靶标药物及亚单位疫苗的研发提供新思路。

2017-2020年华东地区猪源多杀性巴氏杆菌耐药性和PFGE分析

为了解华东地区猪源多杀性巴氏杆菌的耐药情况及流行特征,本研究收集了2017—2020年华东地区分离的31株猪源多杀性巴氏杆菌,通过琼脂稀释法检测其对12种临床常用抗菌药物的最小抑菌浓度;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分子分型探求菌株亲缘关系。结果显示:31株猪源多杀性巴氏杆菌,对复方新诺明的耐药率最高(61.29%),其次为泰妙菌素(32.26%)、氟苯尼考(25.81%)、多西环素(12.90%)和大观霉素(3.23%)。所有菌株对头孢噻呋、庆大霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、恩诺沙星完全敏感;耐药谱型呈现多样化特点,31株猪源多杀性巴氏杆菌共表现为8种耐药谱型,其中有2株3药耐药菌株,耐药谱型分别为DOX+TIA+SPT和FFC+TIA+SXT;依据85%相似性标准可将其分为14个PFGE分型,其中A、G、H、J簇共有19株菌,占61.29%,并且PFGE分型相同的菌株耐药表型也高度相似。研究结果表明,华东地区猪源多杀性巴氏杆菌呈现耐药模式和PFGE分子分型多样化的特性,PFGE分型与耐药表型之间存在一定的相关性,应加强猪源多杀性巴氏杆菌的耐药性监测和流行性防控。

新疆部分地区规模化羊场羔羊多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、绵羊肺炎支原体的调查与分析

为了阐明新疆昌吉、石河子、阿勒泰、塔城及喀什5个地区规模化羊场多杀性巴氏杆菌(Pm)、溶血性曼氏杆菌(Mh)、绵羊肺炎支原体(Mo)的流行情况,试验采集以上5个地区290份6月龄内羔羊鼻拭子样本,提取DNA后采用PCR方法检测Pm、Mh、Mo特异性基因,统计Pm、Mh、Mo的核酸个体总阳性率、单阳性率、双重阳性率和三重阳性率,对3种病原核酸个体总阳性率进行Spearman相关性分析,并分别统计3种病原在不同月龄、不同地区羔羊中的流行情况,采用卡方检验分别对有呼吸道症状和无呼吸道症状羔羊3种病原核酸的单阳性率、双重阳性率和三重阳性率进行差异显著性分析。结果表明:在290份鼻拭子样本中,Pm、Mh、Mo的核酸个体总阳性率分别为6.21%(18/290)、67.24%(195/290)、61.03%(177/290),核酸单阳性率分别为0(0/290)、14.48%(42/290)、8.97%(26/290);Pm-Mh、Pm-Mo、Mh-Mo核酸双重阳性率分别为0.68%(2/290)、0(0/290)和46.55%(135/290),Pm-Mh-Mo核酸三重阳性率为5.51%(16/290)。Pm与Mh的核酸个体总阳性率呈极显著正相关(P<0.01),Pm与Mo的核酸个体总阳性率呈显著正相关(P<0.05),Mh与Mo的核酸个体总阳性率呈极显著正相关(P<0.01)。Pm主要在4月龄羔羊中流行,而Mh和Mo在各月龄羔羊中均普遍流行;Pm主要在石河子市和昌吉市流行,Mh和Mo在各地区均普遍流行。有呼吸道症状的羔羊Pm、Mh核酸单阳性率及Pm-Mo、Pm-Mh核酸双重阳性率与无呼吸道症状的羔羊均差异不显著(P>0.05);有呼吸道症状的羔羊Mh-Mo核酸双重阳性率极显著高于无呼吸道症状的羔羊(P<0.01),Pm-Mh-Mo核酸三重阳性率显著高于无呼吸道症状的羔羊(P<0.05),Mo核酸单阳性率极显著低于无呼吸道症状的羔羊(P<0.01)。说明新疆地区羊群存在Pm感染,Mh和Mo呈普遍流行趋势,因此应加强对易感羊群的病原学检测,做好新疆地区羊呼吸道疾病的防控工作。

荚膜B型多杀性巴氏杆菌外膜囊泡生物学特性分析与免疫效果评价

旨在探究荚膜B型多杀性巴氏杆菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)的生物学特性及免疫保护效果。本研究利用超高速离心和密度梯度离心方法提取荚膜B型多杀性巴氏杆菌的OMVs,通过透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察OMVs的形态及大小,采用SDS-PAGE、LC-MS/MS分析OMVs主要蛋白,以蛋白定量试剂测定其蛋白浓度以及鲎试剂法测定其内毒素含量,然后以新西兰白兔为动物模型,开展免疫保护效果评价。结果显示,荚膜B型多杀性巴氏杆菌的OMVs呈完整规则的球形结构,平均粒径108.3 nm,其中的蛋白质主要集中在33、40、53 ku处,内毒素含量为3.31×10^(6) EU·mL^(-1),用制备的OMVs以50μg·只^(-1)免疫新西兰白兔2次后,免疫兔血清抗体效价可达1∶405 600,外周血淋巴细胞IFN-γ和IL-4转录水平明显升高,对荚膜B型多杀性巴氏杆菌攻击的保护效率为75%。综上表明,荚膜B型多杀性巴氏杆菌的外膜囊泡具有良好的免疫保护效果,有作为候选疫苗的潜质,本研究为外膜囊泡疫苗的研究奠定了基础。

我国中东部主要养猪地区死亡育肥猪呼吸道病原菌的流行病学调查及猪多杀性巴氏杆菌的特性鉴定

【目的】从我国中东部主要养猪地区因呼吸道疾病死亡的育肥猪病料中分离主要病原菌,并进行鉴定和分型,为近年流行的猪呼吸道病原菌的防控治疗提供流行病学依据。此外,对分离的猪多杀性巴氏杆菌(Pm)特性进行鉴定,为Pm疫苗研制提供参考。【方法】收集2021-2023年我国中东部主要养猪地区规模化猪场因呼吸道疾病死亡的育肥猪的病猪肺脏;用血琼脂和TSA培养基分离病原菌,通过微生物学和分子生物学方法鉴定分离菌株;合成adk、est、gdh、mdh、pgi、pmi和zwf基因引物,以分离的Pm为模板进行PCR,通过测序7对管家基因对Pm进行MLST分型;通过PCR对Pm进行荚膜分型和脂多糖分型;通过PCR对Pm的毒力因子进行检测;在ICR小鼠对单一分离的A型和部分D、F型Pm进行毒力鉴定;检测JS-65、JS-51和JS-34在ICR小鼠的LD_(50)。【结果】共分离Pm 73株,分离率为15.53%;分离猪链球菌(SS)71株、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)29株和副猪格拉菌(GPS)10株,分离率分别为15.11%、6.17%和2.13%。分型结果表明,Pm主要为A:L3型,占55%;SS主要为9型,占38.03%;APP主要为15型,占51.72%;GPS主要为5/12型,占60%。混合感染包括Pm+SS,Pm+APP,SS+APP和Pm+APP+GPS,混合感染占总猪群的16.67%。共分离到3种Pm荚膜型:A(67%)、D(30%)和F(3%)型;2种脂多糖型:L3型(56%)和L6型(44%);9种ST分型:ST79、ST50、ST7、ST74、ST13、ST27、ST9、ST287和ST370,所占比例分别为33%、26%、16%、10%、4%、4%、3%、3%和1%。毒力基因检测结果表明:ptfA、fimA、hsf-2、exbB、exbD、tonB、fur、nanH、sodA和sodC的阳性率大于95%;hsf-1、pfhA、tadD、hgbA、hgbB、pmHAS、ompA、ompH、oma87和plpB阳性率在40%-90%之间;tbpA和nanB阳性率在10%-30%;未检出toxA。毒力鉴定结果表明A型菌株在剂量小于10^(2)CFU时导致小鼠全部死亡,D型菌株在10^(3)CFU剂量时小鼠死亡率为60%-100%,F型菌株在5×10^(3)CFU剂量时小鼠死亡率为60%。在ICR小鼠检测JS-65、JS-51和JS-34的LD_(50),结果表明JS-65 LD_(50)<10 CFU,JS-51 LD_(50)=6.3×10^(2)CFU,JS-34 LD_(50)=3.98×10^(3)CFU。【结论】2021-2023年我国中东部主要养猪地区病原菌分离结果表明,Pm、SS、APP和GPS是死亡育肥猪的主要呼吸道病原菌,Pm在肺脏中的分离率最高。采用RIRDC分型鉴定到一株ST370 Pm,拓展了猪Pm的MLST分型数据。Pm优势基因型为A:L3:ST79,其在ICR小鼠中毒力最强,最小致死量小于10 CFU,为后续Pm灭活疫苗研制奠定基础。

肉鸡圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌混合感染的检测与分析

为查明福建省龙岩市某鸡场肉鸡消瘦、呼吸困难、病死率升高原因,对发病鸡进行细菌分离鉴定、16S rDNA鉴定、荚膜分型检测、药物敏感试验等分析;以及进行病毒核酸PCR检测、遗传进化分析。结果显示,从病鸡中分离的细菌在血平板上形成圆形、微突起、表面光滑、奶油状的菌落;分离菌16S rDNA核苷酸序列与GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌的同源性达到99.9%以上,菌株荚膜为A型;该菌对哌拉西林、头孢氨苄、庆大霉素等药物均表现为高度敏感;从病鸡中检测出圆圈病毒3型(GyV3)VP2基因,与GenBank(登录号MK089248)GyV3同源性最高(99.9%)。结果表明,该鸡场发生圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌引起的混合感染病例。

多杀性巴氏杆菌研究概述

多杀性巴氏杆菌在动物群中高度流行,通常是口腔、鼻咽和上呼吸道正常微生物群的组成部分,可导致动物不同程度的感染、甚至死亡,人类可通过被动物咬伤或接触其鼻腔分泌物而被传染,威胁公共卫生安全。本文总结了多杀性巴氏杆菌的形态特征和培养特性,以及血清分型、毒力因子和体内存活机制,有助于理解多杀性巴氏杆菌建立急性和慢性感染的毒力机制;同时,总结了新型疫苗研发现状和治疗方案,旨在提高对该菌感染的防治水平。

禽多杀性巴氏杆菌检验用菌种的研究

为研究禽多杀性巴氏杆菌类兽用生物制品效力评价用菌株,制备了一批禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801株,并对菌种的形态、生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分及毒力等进行检定,进一步评估了冻干菌菌数的稳定性,对冻干菌与新鲜培养菌液的毒力进行了比较。试验结果表明,该冻干菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二○○○版菌种标准的规定。冻干菌菌数保持稳定,并且与新鲜培养的攻毒菌液相比,毒力并无差异。本研究为禽多杀性巴氏杆菌类兽用生物制品效力评价用菌株的制备和检定提供参考依据。

1株羊源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及病原特性研究

【目的】确定齐齐哈尔市某羊场育成绵羊发病和死亡的病原菌,并探究其病原学特性,为该病的有效防治提供科学依据。【方法】无菌采集病死羊肺脏组织,结合临床病征进行实验室诊断,分离培养病原菌。通过形态学观察、生化试验、16S rRNA PCR扩增并测序、kmtⅠ基因鉴定、荚膜血清分型、毒力基因检测、药敏试验、耐药基因检测和小鼠致病性试验对分离菌进行鉴定和病原特性分析。【结果】致病菌株为多杀性巴氏杆菌,分离菌在血平板上长出表面光滑、灰白色的圆形凸起菌落,革兰染色可见聚集成线状或散在单个的革兰阴性短杆菌。生化试验结果显示,该菌能发酵麦芽糖、阿拉伯糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、甘露醇、尿素酶、山梨醇和β-半乳糖苷酶,精氨酸、靛基质试验呈阳性。荚膜血清分型结果显示,分离株为多杀性巴氏杆菌荚膜D型。药敏试验结果显示,分离株对恩诺沙星、杆菌肽和洛美沙星3种药物耐药,对新霉素等4种药物表现为中介,对氨苄西林等16种药物敏感。分离株携带14种毒力基因和6种耐药基因。小鼠感染分离菌后全部死亡。【结论】本研究成功分离到1株D型多杀性巴氏杆菌菌株,其携带多种毒力基因和耐药基因,对小鼠具有较强致病性,研究结果为探究羊源多杀性巴氏杆菌的生物学信息和病原学特征提供了数据。