牛溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌A型、B型的比较鉴定研究

本研究旨在比较牛溶血性曼氏杆菌（M.haemolytica）和牛多杀性巴氏杆菌（P.multocida）A型、B型生理生化特性和PCR鉴定方法,为临床上述三种细菌的分离鉴定提供指导。培养牛溶血性曼氏杆菌、牛多杀性巴氏杆菌A型、B型菌,分别开展革兰氏染色镜检、生化鉴定、生长曲线测定、致病性检测和PCR鉴定。P.multocida A型、B型血平板培养基上P.multocida不溶血、M.haemolytica溶血,在麦康凯培养基上P.multocida不生长、M.haemolytica生长良好;三株细菌在生化特性方面基本相同,但P.multocida能形成靛基质、不发酵肝糖和肌醇,M.haemolytica不能形成靛基质、可分解肝糖和肌醇。三株细菌生长趋势大致相同,均于2～4h进入稳定期,18～20h开始衰退。小鼠感染低至5个P.multocida A型、B型菌可致死,M.haemolytica原液仍不能致死小鼠。所设计各菌株PCR引物能快速鉴定P.multocida A型、B型和M.haemolytica。P.multocida A型、B型和M.haemolytica在部分培养特性、生理生化特征、致病力及PCR鉴定方面存在显著差异。

6株牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2010年～2011年，重庆市多处肉牛场发生牛呼吸道感染致死性病例。从病牛肺组织中分离到多株病原细菌，经细菌形态和培养特性观察、生化试验、小鼠致病性试验及细菌16S rRNA 序列测定，其中6株初步鉴定为多杀巴氏杆菌（Pm）；进一步采用Pm种型特异性基因Kmt-1及hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD PCR扩增，确定该6株Pm均为A型，分别命名为PmCQ （1～6）。对其部分生物特性比较分析表明，6株Pm在马丁肉汤和脑心浸液培养基中生长良好，PmCQ6相比其他几株菌平板培养菌落偏小；小鼠半数致死量（LD50）测定，PmCQ2毒力最强（2.2×10^5 cfu），PmCQ6毒力最弱（1.14×10^8 cfu）；药敏试验表明，6株菌对四环素、丙氟哌酸等多种药物敏感，无明显耐药性。

某牛场奶牛A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

湖北某奶牛场牛群爆发体温升高、呼吸困难、流涎及颈胸皮下气肿等症状的疾病,部分发病牛衰竭死亡,为确诊牛场牛群发病原因并提出防控方案,本试验采集死亡牛的心脏、肝脏、肺脏及气管组织进行病原菌的分离纯化及PCR鉴定,并对鉴定的病原菌进行生化特性鉴定、致病性试验和药物敏感性分析;同时提取患牛血清RNA,开展牛流行热病毒的RT-PCR鉴定。结果显示,病料在类胸膜肺炎固体培养基上不生长,生化特性鉴定显示能形成靛基质、不发酵肝糖和肌醇;牛流行热病毒RT-PCR扩增阴性;所分离的病原菌经16SrRNA及牛A型多杀性巴氏杆菌特异性引物PCR扩增阳性;致病性试验显示该病原可致死小鼠,且能从死亡小鼠体内分离到感染菌;药敏试验结果显示该病菌对头孢哌酮、左氧氟沙星敏感,其他20种临床常见药物表现耐药。综上所述,该牛场患病牛确诊为牛A型多杀性巴氏杆菌感染,建议根据药敏试验结果选择敏感药物,对患病牛进行隔离治疗,疑似患病牛隔离观察,同时加强通风,及时清理污物并消毒,改善饲养管理,避免拥挤、寒冷及长途运输等应激因素。

牛A型多杀性巴氏杆菌分离株的鉴定和免疫原性研究

从湖北黄冈、洪湖、钟祥和河南驻马店发病肉牛场送检病变肺中分离到4株病原菌,经过菌落形态观察、培养特性、生化反应、PCR鉴定等检测,确定这4株临床分离株均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HG、Pm-HH、Pm-ZX和Pm-ZMD。比较4株临床分离株与参考株的生长特性,发现生长曲线与参考株无明显差异。小鼠毒力试验表明,Pm-HG、PmHH和Pm-ZX接种10个菌以下即可将小鼠致死,毒力均很强。将4株菌灭活后免疫小鼠,二免后2周,血清抗体效价都在1∶20 000以上,其中Pm-ZMD和Pm-HG抗体效价最高。用各株菌进行交叉攻击,结果Pm-HG的交叉保护率最高,除能完全保护同种菌的攻击外,对其他3株菌的交叉保护率都在90%以上。因此Pm-HG可望作为进一步研发A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的制苗菌株。

重组牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性研究

为鉴定多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性,本研究从牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌PM-HLJ株的基因组DNA中扩增出大小为1 011 bp的脂蛋白E编码基因(PlpE),经序列测定显示,其氨基酸序列与A型多杀性巴氏杆菌参考株PlpE序列一致性为95.83%。将PM-HLJ的PlpE基因克隆于表达质粒pET-30a(+)并诱导表达,将表达的重组脂蛋白E纯化后经腹腔免疫小鼠,间接ELISA检测结果显示各免疫组均产生了针对重组脂蛋白E的IgG抗体,免疫保护试验显示,当小鼠免疫剂量为20μg、30μg、40μg和60μg时,保护率分别达到20%、40%、80%和100%。结果表明,牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌重组脂蛋白E具有良好的免疫保护作用。

牛源A型多杀性巴氏杆菌pm 0979和pm 0442基因编码蛋白对小鼠的免疫保护性研究

为评价牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm)pm0979和pm0442基因编码蛋白的免疫保护效果,本研究以牛源PmCQ2株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到pm0979、pm0442全长基因,将其分别克隆到pET-30a、pET-32a载体并转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,分别获得大小约41.8 ku(rPM0979)和21.6 ku(rPM0442)的重组蛋白;将其亲合层析纯化后分别免疫小鼠,以PmCQ2株进行攻毒试验,测定其抗体产生情况和保护效果。结果表明,两种重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高水平的抗体;其中rPM0979对小鼠的免疫保护高于rPM0442,保护率可达60%。结果表明,重组蛋白PM0979可作为Pm的一种疫苗候选蛋白,为进一步的疫苗研制奠定了基础。

羊源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了解辽宁省朝阳市某羊场内绵羊体温异常增高、精神萎靡、食欲不佳、严重者1周内死亡的发病原因并提供用药推荐,试验对刚病死的绵羊进行解剖,采集心脏、肺脏和肾脏,收集胸腔积液和鼻拭子作为试验样品进行细菌分离培养、细菌形态学观察、细菌16S rRNA鉴定、多杀性巴氏杆菌荚膜血清型鉴定、生化鉴定、药敏试验、耐药基因检测和致病性试验等。结果表明:导致该羊场羊发病的致病菌为羊源A型多杀性巴氏杆菌。该菌与多杀性巴氏杆菌Pm 5株(AY316314.1)的进化关系最近;且含有B类碳青霉烯酶(VIM)的耐药基因,对庆大霉素、卡那霉素等25种抗生素敏感。说明A型多杀性巴氏杆菌是导致该羊场绵羊死亡的病原菌,该菌携带B类碳青霉烯酶(VIM)耐药基因,对庆大霉素、卡那霉素等抗生素敏感;临床上推荐使用氨基糖苷类(庆大霉素和卡那霉素)和四环素类(四环素)抗生素。

几种消毒药品对A型多杀性巴氏杆菌杀灭效果试验研究

本试验应用威特菌毒清、威特二氯异氰尿酸钠粉、戊二醛癸甲溴铵、氢氧化钠、百毒杀、过氧乙酸、复方次氯酸钠、克辽林8种消毒药物进行了对A型多杀性巴氏杆菌的杀灭效果试验和药物敏感试验,其结果:1∶2 000的威特菌毒清、1∶5 000的威特二氯异氰尿酸钠粉、1∶1 000的戊二醛癸甲溴铵、1∶100的氢氧化钠、1∶1 000的过氧乙酸和1∶100的复方次氯酸钠对A型多杀性巴氏杆菌的杀灭效果最好,在5min内杀灭率均达100%;并且敏感性较高,其抑菌圈的直径均达20mm以上。而百毒杀和克辽林对A型多杀性巴氏杆菌敏感性不高,病菌对其具有较强的抵抗力。

一例牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌与传染性胸膜肺炎的混合感染研究

本文首先调查病牛的感染情况和发病症状,然后解剖死亡牛只,最后采集病牛肺脏组织进行细菌分离和PCR鉴定。结果发现,死亡牛只的胸膜与心包膜发生粘连,肺切面呈大理石样,是胸膜肺炎的典型特征。此外,牛支原体和多杀性巴氏杆菌PCR检测结果均为阳性。由此得出结论:该次疾病是牛支原体以及荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌引起的混合感染。

兔源A型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种特异性强且敏感性高的兔源A型多杀性巴氏杆菌快速检测方法,本研究以兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因为目的基因,设计2对特异性引物进行双重PCR扩增,经反应条件优化,建立检测兔源A型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法。该方法的最佳退火温度为57.8℃,最佳混合引物浓度为0.8μmol/L。该方法特异性强,对兔源A型多杀性巴氏杆菌为kmt1和hyaD基因双阳性,对兔源D型和F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因单阳性,对兔源其它细菌性病原和阴性对照则均为阴性。该方法敏感性高,对兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因的最低检出限分别为1×10^(3)拷贝/μL和1×10^(4)拷贝/μL。该方法重复性好,且与已报道的多重PCR方法的符合率高达96.12%。本研究建立的双重PCR方法对兔源A型多杀性巴氏杆菌具有良好的特异性和敏感性,且重复性好、准确性高,为该病原的快速检测提供了有力的技术支持。

犊牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染的诊治

某奶牛场犊牛相继发生肺炎和关节炎,为确诊该牛场犊牛群发病的原因并提出防控方案,本试验剖检新生犊牛并采集病料,分别开展牛支原体及其他病原菌的分离培养、PCR鉴定及药敏分析;进行牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测;制作犊牛肺脏组织病理切片并进行观察和评估。从犊牛肺脏组织分离到牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌;牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒检测均为阴性;肺脏组织病理切片可见肺泡结构破坏、出血及大量炎性细胞浸润;药敏试验结果显示,牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌分别对泰乐菌素和头孢唑啉敏感,但对青霉素、庆大霉素、林可霉素和氨苄西林均呈现耐药。该犊牛群确诊为牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染,采用泰乐菌素联合头孢唑啉肌肉注射,配合对症治疗和规范管理,有效控制了该场犊牛疾病。

牛源A型多杀性巴氏杆菌(Pm12)灭活疫苗的制备及小鼠攻毒保护试验

为了防控新疆北疆A型多杀性巴氏杆菌(Pm)引起的牛纤维素性化脓性肺炎,分析制备的A型Pm12灭活疫苗在试验小鼠体内抗体产生情况和保护作用,试验按细菌灭活疫苗制备程序将分离筛选自新疆北疆部分地区发病牛场的1株毒性强、免疫原性好的牛源A型Pm12制备成灭活疫苗,并进行安全检验。根据棋盘法对全菌抗原包被浓度、封闭液、血清稀释度、酶标二抗工作浓度、封闭时间、一抗孵育时间、二抗孵育时间及底物反应时间等检测条件进行筛选,建立检测小鼠血清抗体的间接ELISA方法,用建立的间接ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体产生规律,对免疫小鼠以不同半数致死量(LD50)的Pm12进行攻毒保护试验,同时用A型和B型Pm对免疫小鼠进行交叉保护试验。结果表明:制备的牛源A型Pm12灭活疫苗含菌量为8×109cfu/mL,安全检测合格。根据棋盘法确定全菌抗原包被浓度为1∶25,最佳血清稀释度为1∶320~1∶640,最适封闭液为5%BSA,最适封闭时间为1 h,血清最适作用时间为1 h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000,底物最适作用时间为15 min;用制备的疫苗免疫小鼠后,60天的血清抗体效价均高于28天水平;Pm12灭活苗对不同LD50攻毒小鼠的保护率为80%、80%、50%,对A型Pm保护率为80%,对B型Pm的交叉保护率为60%。说明可用试验建立的方法检测小鼠血清抗体水平,制备的牛源A型Pm12灭活疫苗能够诱导小鼠产生较高水平且持续较长时间的血清抗体,能够有效保护小鼠对抗A型Pm感染,且对B型Pm呈现部分交叉保护作用。

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对小鼠的保护性研究

牛溶血性曼氏杆菌及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌是导致牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease,BRD)的重要细菌性病原,每年给养牛业带来巨大的经济损失,目前对其疫苗研究仍显不足。本研究选用牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)Mh422株和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)PmCQ2株作为疫苗菌株,分别制备了2种菌体浓度的Mh和Pm单价灭活菌苗及3种菌量配比(1∶1、2∶1和3∶1)的Mh-Pm二联灭活苗,以小鼠为模型,皮下多点免疫(0.2 mL),加强免疫2次,免疫剂量均为首免的一半。首免后第7天及其后每隔5 d,小鼠尾静脉采血分离血清,ELISA方法检测抗体效价,三免后第20天,分别以Mh422或PmCQ2进行腹腔攻毒测定免疫保护效果。结果显示,所有小鼠接种疫苗均无不良反应,二免后第10天抗体达较高水平,三免后抗体水平持续升高,第15天到达高峰,其后25 d维持高水平,后缓慢下降。Mh单菌苗的2种免疫剂量对Mh422株攻毒的免疫保护率均为0,而Pm单菌苗的2种免疫剂量对PmCQ2株攻毒的免疫保护率全为100%;Mh和Pm间无交叉免疫保护作用;3种菌量配比的Mh-Pm二联疫苗对Mh422株和PmCQ2株攻毒的各自免疫保护率分别为53%~71%和100%。该研究结果表明,所制备的Mh422单菌苗对同型攻毒无免疫保护作用,在诱导机体抗体产生方面,Mh和Pm间无相互抑制作用,PmCQ2株具有促进Mh422株灭活疫苗对Mh422的免疫保护作用,这为牛溶血性曼氏杆菌和牛多杀性巴氏杆菌二联疫苗的进一步研究提供了理论基础。

牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株CQ2和弱毒株CQ6毒力相关基因分析.

为探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株(PmCQ2)与弱毒株(PmCQ6)其所含毒力基因的差异,本研究选择了多杀性巴氏杆菌17个与毒力相关的基因(tbpA、hgbA、hgbB、tonB、ptfA、pfhA、nanB、nanH、toxA、oma87,sodA、sodC、fimA、hsf-1、tadD、pmHaS、hadA)进行检测。试验结果显示,所检测的17个毒力相关基因中,有14个基因在PmCQ2和PmCQ6中都存在,tox A和hgb B基因在两菌株中均未检出,tadD基因仅存在于PmCQ6中。以上结果提示,CQ2株与CQ6株之间的毒力差异原因可能是:除上述所检测的毒力相关基因外,可能还存在其他毒力相关基因;二者毒力基因的表达调控存在差异。

花边鸭源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及主要毒力基因检测

为鉴定一起花边鸭突然发病死亡的病原,从发病鸭中分离到一株致病菌GZZY2019,分离菌在鲜血培养基中呈现圆形、表面光滑、边缘规则、半透明的露滴状小菌落;革兰氏染色镜检显示,分离菌为革兰氏阴性短杆菌;生化鉴定结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、甘露醇等,鸟氨酸、尿素、吲哚等试验阳性;细菌种特异性鉴定结果与多杀性巴氏杆菌相符;荚膜分型鉴定结果仅扩增出约1050bp的基因片段,与荚膜血清A型相符;动物回归试验显示,该分离菌具有较强的致病性;16s rDNA基因序列比对显示该分离菌与多杀性巴氏杆菌LSBS1(GenBank登录号:MN080875.1)同源性高达99.93%;毒力基因检测结果显示该菌能检出kmt1、hgbA、pfhA、nanB、ptfA等毒力因子;药敏试验结果显示,GZZY2019对头孢他啶、丁胺卡那及氯霉素等6种药物耐药。

牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的SSH法筛选

近年来由于牛的频繁调运,由牛源A型多杀性巴氏杆菌引起的牛肺炎型疾病呈现出流行趋势。为探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株间的基因差异,本研究利用抑制消减杂交技术(SSH)对牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株Pm CQ2和弱毒株Pm CQ6进行试验分析,共得到28个差异基因片段,测序比较发现其中27个与毒力、代谢、转录及DNA合成相关的基因片段,另1个基因片段所编码的为假定蛋白。该结果为牛源A型多杀性巴氏杆菌的后续致病机制研究提供了参考。

一株肉牛A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

河北省某肉牛场肉牛发生呼吸困难、咳血及颈胸部气肿等症状的疾病。为快速确诊发病牛的致病原因,及时防控和治疗,无菌采集发病牛的鼻拭子进行病原菌的分离培养、形态学鉴定和毒力测定,并进行PCR检测和测序鉴定。结果显示,病原菌在鲜血琼脂培养基上呈圆形的水滴样菌落,革兰氏染色为球形或短杆状的阴性菌。多杀性巴氏杆菌种属特异性引物PCR扩增为阳性,荚膜血清分型鉴定为A型,经16S rDNA测序鉴定分离的病原菌为多杀性巴氏杆菌,小鼠的最小致死量为3个菌/mL。本研究为该牛场发病牛的防治提供了依据,也为研制高效疫苗提供了优势菌种。

云南猪源A型多杀性巴氏杆菌PMJC-1株的分离鉴定

为探明2022年2月玉溪市江川区某规模猪场大批保育猪发病死亡原因,对采集病料进行了细菌分离,从肺门淋巴结分离得到一株菌落表面光滑、湿润、半透明圆形菌株。分离菌株经生化试剂条鉴定为多杀性巴氏杆菌,分离菌株的16S rRNA序列与NCBI GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌PM8-6株的同一性达到99%以上,将分离菌株命名为PMJC-1株。荚膜分型结果显示该菌株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,毒力基因检测结果显示该菌含有黏附素、超氧化物歧化酶等6种毒力基因。分离菌株药敏试验表明,其仅对利福平、头孢哌酮、阿莫西林、呋喃妥因、头孢噻吩、大观霉素6种药物敏感,对其余18种药物均耐药。动物致病性试验结果显示该菌株对昆明小鼠具有较强致病性,8只实验组昆明小鼠在接种后72 h内发病死亡5只,其余3只发病后耐过康复。本研究结果可为生猪养殖过程中A型多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考。

猪A型多杀性巴氏杆菌培养基改良的初步探讨

采用改良猪肺疫和常规猪肺疫疫苗用两种培养基培养猪A型多杀性巴氏杆菌,对其培养液进行活菌数测定。实验结果表明,运用改良猪肺疫培养基培养,小批量与反应罐试验测得活菌数分别可达1.3×109～1.7×109CFU/mL、6.8×108～7.5×109CFU/mL;运用常规猪肺疫培养基培养,小批量与反应罐试验测得活菌数分别可达8.0×108～1.0×109CFU/mL、3.5×109～3.7×109CFU/mL,可选择改良猪肺疫培养基替代常规猪肺疫培养基培养,用于制备A型猪多杀性巴氏杆菌病疫苗。

牦牛呼吸道合胞体病毒与A型巴氏杆菌混合感染的诊断

2023年5月川西北某牦牛养殖场暴发呼吸道疾病并出现死亡,本试验的目的是对此疫情进行病原学诊断。采集了3份病死牦牛肺脏样本,采用PCR方法对肺脏样本进行了10种常见呼吸道病原的检测。结果显示,2份样本检出牛呼吸道合胞体病毒,2份样本检出A型多杀性巴氏杆菌,其中1份样本同时检出牛呼吸道合胞体病毒和A型多杀性巴氏杆菌。结合临床资料和实验室检测结果,诊断该养殖场牦牛暴发的呼吸道疾病是由牛呼吸道合胞体病毒和A型多杀性巴氏杆菌混合感染引起的,为该场牦牛的疾病防治提供可靠依据。