西藏那曲市牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及基因组分析

旨在对引起西藏牦牛呼吸道感染的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定,明确病原菌的血清型、耐药性和致病性等生物学特性及基因组特征和遗传进化关系。本研究从西藏林芝、拉萨、那曲地区采集牦牛鼻咽拭子和组织病料498份,进行流行病学调查、细菌学分离纯化、生化试验、PCR鉴定、K-B药敏试验、动物致病性试验和分离株全基因组测序,并通过Mauve软件和MEGA 7软件进行基因共线性和系统进化分析。结果显示,经细菌分离纯化、生化试验及PCR鉴定,发现在西藏林芝、拉萨、那曲地区巴氏杆菌阳性率为2.61%,且从病死牦牛肺组织中分离出B型多杀性巴氏杆菌菌株,命名为“Pm XZ01”株;药敏试验发现Pm XZ01株对头孢菌素类、喹诺酮类、羧苄西林、丁胺卡那、复方新诺明和氯霉素类抗生素敏感;动物试验发现感染Pm XZ01株的家兔(1.2×10^(8) CFU·mL^(-1))和小鼠(1×10^(7) CFU·mL^(-1))死亡率高达100%,说明在该浓度下Pm XZ01株具有较强的致病性和致死性。全基因组测序获得Pm XZ01株全基因组大小为2331787 bp,GC含量为40.47%,重复序列总长度为3266 bp;含有121个非编码RNA基因,包括59个tRNA基因,19个rRNA基因,43个ncRNA基因;2个假基因,5个基因岛,3个前噬菌体,68个碳水化合物活性酶基因;CARD注释分析发现1个PBP3抗性基因和2个EF-Tu抗性基因;VFDB和PHI-base注释分析发现101个毒力因子相关基因及663个表型突变基因等;共线性分析发现Pm XZ01株与猪源HB03株(CP003328.1)、HN07株(CP007040.1)和禽源P1702株(CP097616.1)共线性最好,而与牦牛源Tibet-Pm1株(CP072655.1)共线性较差;系统进化树分析发现Pm XZ01株与中国广东牛源GDZQ201401株(KP083466.1)属于同一分支,进化关系最近。本研究完成了西藏牦牛巴氏杆菌病的流行病学调查,以及牦牛源B性多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、生物学特性和全基因组测序分析,为探索西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌病的流行规律和致病机制以及防控提供了参考。

牛溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌A型、B型的比较鉴定研究

本研究旨在比较牛溶血性曼氏杆菌（M.haemolytica）和牛多杀性巴氏杆菌（P.multocida）A型、B型生理生化特性和PCR鉴定方法,为临床上述三种细菌的分离鉴定提供指导。培养牛溶血性曼氏杆菌、牛多杀性巴氏杆菌A型、B型菌,分别开展革兰氏染色镜检、生化鉴定、生长曲线测定、致病性检测和PCR鉴定。P.multocida A型、B型血平板培养基上P.multocida不溶血、M.haemolytica溶血,在麦康凯培养基上P.multocida不生长、M.haemolytica生长良好;三株细菌在生化特性方面基本相同,但P.multocida能形成靛基质、不发酵肝糖和肌醇,M.haemolytica不能形成靛基质、可分解肝糖和肌醇。三株细菌生长趋势大致相同,均于2～4h进入稳定期,18～20h开始衰退。小鼠感染低至5个P.multocida A型、B型菌可致死,M.haemolytica原液仍不能致死小鼠。所设计各菌株PCR引物能快速鉴定P.multocida A型、B型和M.haemolytica。P.multocida A型、B型和M.haemolytica在部分培养特性、生理生化特征、致病力及PCR鉴定方面存在显著差异。

B型多杀性巴氏杆菌感染诱导NLRP3炎症小体激活及IL-1β分泌

为研究B型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida serotype B,PmB)感染巨噬细胞后诱导IL-1β成熟与分泌的机理,本研究用PmB分别体外感染WT、Casp1^(-/-)、Asc^(-/-)和Nlrp3^(-/-)小鼠巨噬细胞,通过ELISA、qRT-PCR和Western blot方法检测上述感染体系中IL-1β的表达与分泌,并通过检测PmB黏附和侵入巨噬细胞的情况,阐述吞噬作用对IL-1β分泌的影响。结果显示,PmB感染WT小鼠巨噬细胞后能够引起IL-1β的表达与分泌,但感染Casp1^(-/-)、Asc^(-/-)、Nlrp3^(-/-)小鼠巨噬细胞后IL-1β的分泌受损且极显著低于WT小鼠(P<0.01),表明Caspase-1、ASC、NLRP3蛋白均参与IL-1β的成熟与分泌过程;此外,PmB感染巨噬细胞后,可检测到成熟形式的Caspase-1,表明Caspase-1在IL-1β的分泌过程中发挥着重要作用。进一步研究发现,巨噬细胞吞噬PmB的作用对IL-1β的分泌有促进作用,抑制巨噬细胞吞噬作用后IL-1β的分泌同样受到显著影响(P<0.01)。结果表明,PmB感染巨噬细胞后通过激活NLRP3炎症小体信号通路活化Caspase-1,促进IL-1β的成熟与分泌发挥抗感染作用,同时IL-1β的分泌与巨噬细胞的吞噬作用相关,为研究PmB的致病机理以及疾病治疗的诊断靶标提供一定依据。