构建过表达/干扰多梳蛋白2的人胶质瘤细胞系

目的构建过表达/干扰多梳蛋白2(polycomb-like 2,PCL2)基因重组慢病毒并稳转胶质瘤U251细胞系。方法过表达PCL2重组慢病毒载体pLVX-hPCL2-3flag-ZsGreen-Puro和干扰PCL2重组慢病毒载体pLVX-shRNA2-Puro-hPCL2通过克隆技术成功构建,在293T细胞中导入质粒载体完成慢病毒包装,经过干预HEK293获得转染效率,病毒滴度采用逐孔稀释梯度法测得。将构建好的hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒转染胶质瘤U251细胞,倒置显微镜下观察荧光强度及范围,Western blot检测PCL2蛋白的表达情况。结果成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒载体,Western blot结果显示,相比对照组和空载组,目的蛋白在转染过表达PCL2重组慢病毒U251细胞中表达明显升高,在转染干扰PCL2重组慢病毒U251细胞中表达降低(P均<0.05)。结论成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒的U251细胞系。

家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析

多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。

神经系统多梳蛋白1在神经系统来源细胞中的表达及促增殖作用

目的检测神经系统多梳蛋白1(NSPc1)基因在神经系统来源的细胞中亚细胞定位及表达水平,探索NSPc1基因表达水平与神经系统来源的细胞增殖能力的关系。方法使用细胞免疫荧光与激光共聚焦技术检测人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系中内源性的NSPc1蛋白及外源过表达的绿色荧光蛋白-NSPc1融合蛋白的亚细胞定位情况。使用流式细胞术检测NSPc1基因过表达对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系细胞周期的影响。使用实时荧光定量聚合酶链式反应方法检测正常人脑组织与16例不同世界卫生组织分级的人胶质瘤样品中NSPc1基因的mRNA表达水平差异。结果 NSPc1蛋白主要定位于SH-SY5Y细胞的细胞核。过表达NSPc1显著增加SH-SY5Y细胞处于S期的细胞比例,而减少G2期的比例。人胶质瘤样品中NSPc1基因的mRNA平均表达水平高于正常人脑组织。结论NSPc1基因的高表达能促进神经系统来源的细胞增殖,NSPc1高表达可能与胶质瘤恶性度相关。

人多梳蛋白2和Ki67在鼻咽癌中的表达及预后意义

目的检测人多梳蛋白2(HPC2)和Ki67在鼻咽癌组织中的表达,探讨其表达与临床病理因素的关系,揭示两者表达相关性及其预后意义。方法采用Western blot法检测HPC2在鼻咽癌及非肿瘤鼻咽上皮组织中的表达,进一步选取126例鼻咽癌活检石蜡组织标本,免疫组化法检测HPC2和Ki67的表达情况,结合临床病理资料及随访数据统计分析。结果HPC2在鼻咽癌组织的表达较鼻咽非肿瘤组织的表达上调,HPC2和Ki67的蛋白表达均定位于鼻咽癌组织细胞核,HPC2高表达占55.6%,Ki67高表达占61.9%。HPC2的表达与鼻咽癌的TNM分期、复发、转移有关。HPC2和Ki67的表达呈正相关(r=0.354,P<0.01)。HPC2和Ki67联合检测在NPC的无进展生存(PFS)和总生存(OS)的预后风险模型显示,两者均高表达者为高风险组,预后最差,两者表达不一致为中度风险,预后中等;如果两者均低表达为低度风险,预后最好(P=0.000)。结论HPC2高表达状态与鼻咽癌临床进展及预后不良有关,联合Ki67检测的预后模型有利于更准确地评估预后。

干细胞调控因子神经系统多梳蛋白1的全基因组范围结合靶点分析

背景:在胚胎发育早期神经系统高表达的多梳蛋白家族成员神经系统多梳蛋白1具有明确转录抑制作用。最近研究表明,神经系统多梳蛋白1可能是一个有别于同源基因Bmi1的新的神经干细胞调控因子。目的:检测体外神经细胞分化模型小鼠畸胎瘤P19细胞中神经发育相关表观遗传调控因子神经系统多梳蛋白1在基因组上的结合靶点。方法:扩增未分化状态的小鼠畸胎瘤P19细胞系(内源性高表达神经系统多梳蛋白1基因),使用兔源抗神经系统多梳蛋白1多克隆抗体进行P19细胞的染色质免疫沉淀实验,并结合采用高通量芯片检测技术(ChIP-on-chip)检测捕获靶基因序列,最后利用生物信息学在线软件分析神经系统多梳蛋白1结合靶点临近基因功能的分类特点。结果与结论:筛选出约1280个神经系统多梳蛋白1结合靶点,靶点临近或所在基因的功能主要与分化、发育、转录及其调节、神经发生等密切相关。提示全基因组结合靶点分析可有效揭示神经系统多梳蛋白1基因在体外神经干细胞分化模型P19细胞中结合并可能参与调控的靶基因谱的分布特点,有利于下一步深入开展干细胞调控相关因子神经系统多梳蛋白1的下游信号通路研究。

不同临床分期宫颈癌患者血清细胞间黏附因子-1、人多梳蛋白2水平变化与其疾病转归的关联性分析

目的:研究不同临床分期宫颈癌患者血清细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、人多梳蛋白2(HPC2)水平变化及与其疾病转归关联性。方法:选取2018年3月~2019年3月我院宫颈癌患者114例,均检测其血清ICAM-1、HPC2水平,比较治疗前宫颈癌不同临床分期与治疗后进展、无进展患者血清ICAM-1、HPC2水平,分析治疗前血清ICAM-1、HPC2水平与临床分期的相关性及治疗后血清ICAM-1、HPC2水平联合检测对治疗后1年宫颈癌患者病情进展的预测价值。结果:随着宫颈癌患者临床分期的提升,血清ICAM-1、HPC2水平呈逐渐升高趋势(P<0.05);经Spearman相关性分析,宫颈癌患者血清ICAM-1、HPC2水平与临床分期呈正相关(P<0.05);宫颈癌患者治疗后血清ICAM-1、HPC2水平低于治疗前(P<0.05);治疗后进展患者血清ICAM-1、HPC2水平高于无进展患者(P<0.05);经ROC曲线分析,联合预测AUC值0.843高于ICAM-1、HPC2单一检测(P<0.05)。结论:宫颈癌患者血清ICAM-1、HPC2水平显著升高,与临床分期密切相关,且联合检测可提高对疾病转归的预测价值,有助于临床治疗方案的制定与调整。

血清细胞间黏附因子-1、人多梳蛋白2水平变化与宫颈癌患者临床分期、疾病转归的关联性分析

目的:探讨血清细胞间黏附因子-1(ICAM-1),人多梳蛋白2(HPC2)水平变化与宫颈癌患者临床分期、疾病转归的关联性。方法:选取2020年1月-2021年1月医院收治的宫颈癌患者88例,所有患者均接受血清ICAM-1,HPC2水平检测,采用Spearman相关性分析法分析I CAM-1、HPC2水平与宫颈癌患者临床分期的相关性,采用单因素分析影响宫颈癌患者疾病转归的相关因素,以Logistic回归分析明确危险因素。结果:随着宫颈癌临床分期的提高,血裔ICAM-1、HPC2水平随之升高(P<0.05);经Spearman相关分析,结果显示宫颈癌患者血清ICAM-1,HPC2水平与临床分期呈正相关(r=0.437,r=0.415,P<0.05);进展组HI期、N期、吸烟史、并发症占比高于未进展组(P<0.05),进展组病灶直径、ICAM-1、HPC2水平均高于未魏展组(P<0.05);Logistic回归分析显示ICAM-1、HPC2水平升高是导致宫颈癌进展的危险因素。结论:ICAM-1、HPC2在宫颈癌患者中的表达能反映病情的严重程度,是导致疾病进展的危险因素,对于预后预测有较好的效能。

多梳蛋白Nspc1对微管基因Tubulin βⅢ启动子活性的影响

【目的】克隆TubulinβIII基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中并检测多梳蛋白Nspc1对其活性的影响。【方法】提取小鼠畸胎瘤细胞系P19的DNA,PCR扩增TubulinβIII近端启动子片段,构建2个不同长度的p GL3basic-TubulinβIII荧光素酶报告基因载体,双酶切及测序确定所扩增的DNA序列,将重组的报告基因载体与转录调控因子多梳蛋白Nspc1瞬时共转染小鼠畸胎瘤细胞系P19细胞,使用双荧光素酶报告基因检测系统检测Nspc1对TubulinβIII启动子活性的影响。【结果】鉴定结果表明构建的TubulinβIII启动子序列正确,P19细胞中双荧光素酶活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,并对转录调控因子Nspc1有应答。【结论】成功构建了TubulinβIII荧光素酶报告基因载体,为进一步在多能干细胞分化模型中研究多梳蛋白Nspc1对TubulinβIII基因的表达调控机制奠定了重要基础。

锯缘落地生根的器官特征及多梳蛋白KsRING1的组织表达分析

在拟南芥中,多梳蛋白抑制复合体1 (PRC1)的核心组分AtRING1作为重要的表观遗传因子,其功能缺失导致植物在营养阶段产生胚性愈伤结构,这与落地生根叶生无性苗的发生相类似。本研究首先系统观察了锯缘落地生根主要器官的结构特征,探讨了锯缘落地生根整体发育模式。然后通过同源克隆技术获得2个AtRING1在锯缘落地生根的同源基因并命名为KsRNG1a和KsRING1b,GenBank登录号分别为MH144360和MH144361。实时定量PCR结果表明, KsRING1a/b基因广泛表达于锯缘落地生根的不同组织器官中,表明其功能贯穿于植物生长发育的整个时期。特别是KsRING1a/b的表达量在叶缘无性苗中的表达最高,这与拟南芥同源基因AtRING1a/b在种子胚中的高表达一致,不同于AtRING1突变导致的体细胞胚性结构发生,这表明锯缘落地生根叶缘无性苗的发生过程更接近于常规的种子胚发生方式。

多梳蛋白抑制复合物2抑制剂的药物专利分析

多梳蛋白抑制复合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2)具有组蛋白甲基转移酶活性,其亚基包括zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homologue 2,EZH2)和胚胎外胚层发育蛋白(embryonic ectoderm development,EED),相关小分子抑制剂的研发成为了当前表观遗传学抗肿瘤策略的热点领域。本文基于PRC2专利文献披露的信息,梳理与分析了2000—2020年PRC2抑制剂的技术发展以及对代表性药物分别进行了核心专利、临床试验和同族专利情况分析,揭示了目前在研的前沿药物发展进度,旨在为科学家和科研管理决策提供科学依据和参考借鉴。

多梳蛋白4与含FERM结构域蛋白4A在胃癌组织中的表达及与意义

目的:探讨胃癌组织中多梳蛋白4(Cbx4)和含FERM结构域蛋白4A(FRMD4A)表达及其与胃癌患者临床病理参数及预后的关系。方法:收集2010年2月-2013年11月收治的112例胃癌患者的手术标本(癌组织及癌旁组织)及临床病理资料,用qRT-PCR和免疫组化法中检测标本中Cbx4、FRMD4A mRNA与蛋白表达;分析胃癌组织Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平与临床病理参数及生存率的关系,并分析影响胃癌预后的因素。结果:与癌旁正常组织比较,胃癌组织中Cbx4和FRMD4A mRNA与蛋白表达水平均明显升高(均P<0.05)。Cbx4及FRMD4A蛋白表达水平与胃癌患者T分期、N分期、分化程度及远处转移明显有关(均P<0.05);Cbx4、FRMD4A蛋白阳性表达组胃癌患者5年生存率均明显低于各自阴性表达组患者(χ^2=15.42,P=0.000;χ^2=21.55,P=0.000)。Cox多因素分析显示,Cbx4(HR=2.754,95%CI=1.827~4.151,P=0.000)和FRMD4A(HR=3.129,95%CI=2.282~4.290,P=0.000)蛋白表达水平以及T分期(HR=1.432,95%CI=1.241~1.652,P=0.005)、远处转移(HR=1.257,95%CI=1.208~1.308,P=0.032)是影响胃癌患者预后的独立危险因素。结论:Cbx4及FRMD4A在胃癌组织中高表达,且与患者的不良临床病理特征及预后密切相关,可能对胃癌病情评估及预后判断有一定意义。

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究。

构建干扰多梳状蛋白2的人胶质瘤U251细胞系

目的建立稳定干扰多梳状蛋白2(polycomb like 2,PCL2)的人胶质瘤U251细胞系。方法针对PCL2基因的shRNA克隆至miR30前体骨架shRNA表达载体,用PCR鉴定载体构建成功后转入HEK293细胞,得到重组腺病毒Ad5-E1-AmU6-PCL2 shRNA-E3-CMV-eGFP;将重组腺病毒转染至U251细胞中,分组为空白对照组、空载体组和PCL2 shRNA组,滴度梯度设置为MOI(20∶1,50∶1,100∶1),使用荧光显微镜观察腺病毒感染效率;用Western blot检测U251细胞内shRNA PCL2表达载体的基因沉默效率。结果使用小RNA干扰技术,成功构建了表达PCL2 shRNA的重组腺病毒;荧光显微镜观察发现MOI(50∶1)时,U251细胞感染效率最高,细胞生长状态良好。Western blot结果显示PCL2 shRNA重组腺病毒组的PCL2蛋白水平较空白对照组和空载体组明显降低,以100∶1时的PCL2表达量最低,干扰效果最显著。结论成功构建的PCL2 shRNA重组腺病毒能够在体外有效感染U251细胞,降低U251细胞中PCL2的蛋白表达并筛选出稳定沉默的细胞系。

纪俊峰教授团队揭示多梳家族蛋白PHC1在多能性维持中的重要作用

021年5月14日,浙江大学纪俊峰教授团队在《自然·通讯》(Nature Communications)发表了题为"PHC1 maintains pluripotency by organizing genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus"的研究论文(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8121881),发现多梳家族(polycomb group)蛋白PHC1一方面通过多梳抑制复合物1(polycomb repressive complex 1)依赖的功能沉默发育分化基因.

NSPc1相互作用蛋白的筛查及其与组蛋白乙酰化酶HBO1相互作用的验证

目的寻找多梳家族(polycomb group)蛋白NSPc1的体内可能的相互作用蛋白。方法通过酵母双杂交实验筛选与NSPc1相互作用的蛋白。使用Pull-down实验,Co-IP实验以及细胞内荧光共定位实验进一步证实双杂交中发现的相互作用。结果分别以NSPc1蛋白的全长、N端和C端作为诱饵筛查人3月胎脑cDNA文库,发现N端诱饵可以与组蛋白乙酰化转移酶HBO1相互作用,该相互作用在体内外实验中都得到了验证。结论组蛋白乙酰化酶HBO1是NSPc1的相互作用蛋白之一,该相互作用可能参与NSPc1对靶基因转录的表观抑制活性的发挥。

环指蛋白1B与肿瘤的研究进展

多梳家族蛋白(PcG)参与多种细胞生命活动,包括细胞周期调控、癌变、老化、X染色体失活、决定细胞结局及干细胞分化,是一类染色质水平上通过表观遗传修饰调控靶基因的转录因子。环指蛋白1B(RNF2)作为PcG的重要成员,具有环指结构域,凭借其E3连接酶的特性可催化组蛋白2A(H2A)119位赖氨酸单泛素化,从而通过压缩染色质造成基因沉默并抑制转录延长阶段的进行,在干细胞增殖分化、维持干细胞自我更新能力中发挥重要作用。而且有研究发现RNF2与多种肿瘤的发生、发展、预后相关,有可能成为判断预后的生物标志物和潜在的治疗靶标。

不同浓度LBH589对人前列腺癌PC3细胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表达的影响

目的观察不同浓度组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对人前列腺癌PC3细胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表达的影响。方法选择1、10、100 nmol/L的LBH589处理PC3细胞,采用MTT法测算细胞增殖抑制率,实时定量PCR、Western blotting法分别检测细胞EZH2的mRNA和蛋白。结果随着浓度和时间的增加,LBH589对PC3细胞的抑制作用呈现明显的时间-剂量关系(P均<0.05)。相同时间时,随着LBH589浓度的增加,PC3细胞EZH2的mRNA、蛋白表达逐渐降低(P均<0.05);相同浓度时,随着时间的延长,PC3细胞EZH2的mRNA、蛋白表达逐渐降低(P均<0.05)。结论 LBH589可抑制PC3细胞的增殖,同时可使细胞EZH2的mRNA及蛋白表达降低,且随着浓度的增加作用增强。

EZH2抑制剂与膀胱癌GC化疗药物联用增敏的作用研究

目的探究多梳蛋白zeste基因增强子类同源物2(histone methyltransferase enhancer of Zeke 2,EZH2)抑制剂对膀胱癌治疗中吉西他滨联合顺铂(gemcitabine and cisplatin,GC)化疗方案中的增敏作用。方法首先构建EZH2 siRNA敲低系,然后使用qPCR与WB检测验证siRNA在膀胱癌UCC细胞中的表达水平。根据不同的处理分为对照组(膀胱癌T24细胞正常培养)、GC化疗组(T24细胞+GC化疗药物)、si EZH2转染组(T24细胞+si EZH2转染+GC化疗药物)、GSK126抑制剂组(T24细胞+GSK1265μM+GC化疗药物)、UNC1999抑制剂组(T24细胞+UNC19995μM+GC化疗药物)、EI1抑制剂组(T24细胞+EI15μM+GC化疗药物)、DZNep1抑制剂(T24细胞+DZNep15μM+GC化疗药物)与EPZ005687抑制剂(T24细胞+EPZ0056875μM+GC化疗药物),采用CCK-8、平板克隆形成与Annexin/PI等实验分别检测8组细胞增殖率、凋亡率及其对细胞周期影响。随后将30只BALB/C雌裸鼠随机分为对照组(膀胱癌T24细胞正常培养)、T24细胞+EZH2抑制剂的溶媒缓冲液组、T24细胞+GC化疗组、T24细胞+UNC1999 EZH2抑制剂组与T24细胞+UNC1999 EZH2抑制剂+GC化疗组,每组6只。裸鼠成瘤实验检测转染后各组UCC细胞移植瘤的生长情况,免疫组化染色法观察移植瘤组织中Ki67和EZH2的表达,血常规检测白细胞、红细胞及血小板数量裸鼠骨髓抑制情况。结果在已转染了siRNA质粒的T24细胞中,siEZH2-1与siEZH2-2在siRNA与蛋白表达水平上与对照组的差异有统计学意义(P<0.01)。在细胞实验中,与对照组相比,上述7组实验组通过CCK-8、平板克隆与Annexin V/PI双染、Pi单染实验发现EZH2抑制剂可以抑制T24细胞的增殖、迁移和侵袭能力,早期凋亡细胞比例上调(P<0.01)。其中在平板克隆实验中,实验组T24细胞+EPZ0056875μM+GC化疗药物组细胞克隆数与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠体内实验表明,与对照组相比,经GC化疗药物或EZH2抑制剂的裸鼠瘤体重量减少(P<0.05),并且在血常规检测中血细胞含量也有所增高。结论EZH2抑制剂能够提高膀胱癌GC化疗方案的敏感性,从而降低膀胱癌细胞的增殖、迁移与裸鼠体内移植瘤的生长。同时,联合用药也能够显著减少其骨髓抑制情况。提示协同治疗在膀胱癌化疗增敏中具有一定的作用。

CBX4与肿瘤的研究进展

多梳蛋白家族(polycomb group proteins,PcG)是通过修饰染色质对靶基因进行转录抑制的表观遗传调控复合物。研究发现CBX4能介导与疾病发生的相关信号通路,从而参与增殖、分化及预后等生物学过程。该文就CBX4与肿瘤发生的相关机制及潜在的临床应用价值等方面的研究作一综述。

EZH2在非小细胞肺癌发生发展中的作用

Enhancer of zeste homolog(EZH2)是属多梳蛋白抑制复合物(polycomb repressive complex 2,PRC2)中的一个催化亚基,通过介导组蛋白H3K27甲基化和恢复DNA甲基化酶活性而沉默多种基因。EZH2异常表达与多种肿瘤的发生密切相关,EZH2可促进非小细胞肺癌细胞的生长和侵袭,在早期非小细胞肺癌组织中EZH2高表达。本文讨论EZH2及PRC2复合物在组蛋白H3K27甲基化和基因组稳定性中的作用。同时,讨论在肿瘤中EZH2的进展及调控的下游因子作用,并展望EZH2在非小细胞肺癌个体化治疗中的前景。