自噬在多氯联苯118致大鼠甲状腺组织损伤中的作用机制

目的探讨自噬在慢性低浓度[0~1 000μg/(kg·d)]多氯联苯118(PCB118)导致大鼠甲状腺组织损伤中的作用机制。方法将40只雄性Wistar大鼠随机分为A、B、C、D组,每周腹腔注射0、10、100、1 000μg/(kg·d)PCB118 5次,共13周。PCB118处理结束后,处死大鼠取甲状腺组织,用透射电子显微镜观察大鼠甲状腺组织超微结构。采用蛋白免疫印迹法检测甲状腺组织自噬相关蛋白LC3、P62、BECLIN1及β-Ⅲ型微管蛋白(Tubb3)/死亡相关蛋白激酶2(DAPK2)-通路相关蛋白[Tubb3、DAPK2、肌球蛋白调节轻链(MRLC)、磷酸化MRLC(p-MRLC)、自噬相关基因9A(ATG9A)]。采用实时荧光定量PCR法检测Tubb3/DAPK2-通路相关基因[Tubb3、DAPK2、非肌肉肌球蛋白重链IIA(NMMHC-ⅡA)、ATG9A]。结果与A组比较,B、C、D组甲状腺滤泡细胞损伤、部分空泡化,线粒体密度下降、嵴膜消失,伴内质网扩张,且上述改变在C组最为明显,C、D组出现典型的自噬小体。与A组比较,B组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高(P均<0.05);C、D组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表达升高,P62蛋白表达降低(P<0.01)。与B组比较,C组BECLIN1蛋白表达升高(P均<0.01);D组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表达升高,P62蛋白表达降低(P均<0.05)。与C组比较,D组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表达升高(P均0.01)。与A组比较,C、D组Tubb3蛋白表达降低(P均<0.01),DAPK2蛋白表达、p-MRLC/MRLC升高(P均<0.05)。与B组比较,C组Tubb3蛋白表达降低,DAPK2蛋白表达升高(P均<0.05);D组Tubb3蛋白表达降低,DAPK2、MRLC、p-MRLC蛋白表达及p-MRLC/MRLC升高(P均<0.05)。与C组比较,D组DAPK2蛋白表达降低,MRLC、p-MRLC蛋白表达及p-MRLC/MRLC升高(P均<0.05)。与A组比较,B组Tubb3 mRNA降低,DAPK2、ATG9A mRNA升高(P均<0.05);C组Tubb3 mRNA降低,DAPK2、NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA升高(P均<0.05);D组Tubb3表达降低,NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA升高(P均<0.05)。与B组比较,C组DAPK2、ATG9A mRNA升高(P均<0.01)。与C组比较,D组DAPK2、ATG9A mRNA降低(P均<0.05)。结论自噬在慢性低浓度PCB118导致大鼠甲状腺组织损伤中起重要作用,其作用机制可能与Tubb3/DAPK2-相关信号通路有关。

多氯联苯118诱导大鼠非酒精性脂肪肝病的研究

目的:探讨慢性低浓度多氯联苯118(polychlorinated biphenyl 118,PCB118)是否引起大鼠非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)及其机制。方法:Wistar大鼠随机分为4组,腹腔注射PCB118[10、100和1 000μg/(kg·d)]或玉米油[0.5 mL/(kg·d)]13周。检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平及白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达水平。HE及天狼星红染色观察肝脏脂肪变性、炎症细胞浸润及纤维化程度。结果:不同浓度PCB118刺激后与对照组比较,血清ALT、TG、TC、GLU、LDL-C、HDL-C水平显著增加(P <0.01),血清AST水平略有增加但差异无统计学意义。IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-2、α-SMA mRNA水平显著增加(P<0.05)。HE染色示肝脏脂肪变性、炎症浸润,天狼星红染色示肝小叶结构紊乱,明显纤维化。结论:慢性低浓度PCB118通过炎症机制促进肝脏纤维化,诱导大鼠NAFLD发生。

腹腔注射多氯联苯118的雄性大鼠甲状腺功能变化观察及其机制探讨

目的观察多氯联苯118(polychlorinated biphenyl 118,PCB118)腹腔注射的雄性大鼠甲状腺功能变化及组织衰老程度,并探讨其可能作用机制。方法24只雄性Wistar大鼠随机分为A、B、C及对照组4组,每组6只。A、B及C组大鼠分别用10、100、1000μg/(kg·d)的PCB118腹腔注射,对照组用等容积玉米油腹腔注射,各组均注射1天/次,一周5次,共注射13周。造模结束时处死各组大鼠,心脏取血,ELISA法检测大鼠血清游离甲状腺素(FT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)及促甲状腺激素(TSH)。取甲状腺组织,采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色评估甲状腺组织衰老情况;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠甲状腺组织衰老基因(p16、p21、p53)、衰老相关分泌表型(SASP)中的部分因子[白细胞介素-1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)、基质金属肽酶13(MMP13)]mRNA以及线粒体动力学相关蛋白[线粒体自噬调节因子PTEN诱导激酶1(PINK1)、线粒体动力相关蛋白1(DNM1L)、线粒体融合蛋白1(MFN1)、线粒体融合蛋白2(MFN2)]mRNA。结果A、B及C组大鼠血清FT3和FT4水平呈PCB118剂量依赖性降低,TSH水平呈剂量依赖性升高;与对照组比较,B、C组大鼠血清FT3和FT4水平显著下降,TSH水平显著升高(P均<0.05)。与对照组比较,A、B、C组大鼠甲状腺组织SA-β-gal染色阳性率高(P均<0.05);与A、B组比较,C组大鼠甲状腺组织SA-β-gal染色阳性率进一步增高(P均<0.05)。与对照组比较,B、C组大鼠甲状腺组织p16、p21基因相对表达量升高(P均<0.05)。与对照组比较,A、B、C组大鼠甲状腺组织IL-6 mRNA及MMP13 mRNA相对表达量升高,B组大鼠甲状腺组织TNFαmRNA相对表达量升高(P均<0.05);与B组比较,C组大鼠甲状腺组织TNFαmRNA相对表达量下降(P<0.05)。与对照组比较,A组甲状腺组织DNM1L mRNA、MFN1 mRNA相对表达量升高(P均<0.05),B组甲状腺组织PINK1 mRNA、DNM1L mRNA、MFN1 mRNA相对表达量升高(P均<0.05),C组甲状腺组织DNM1L mRNA及MFN2 mRNA相对表达量降低(P均<0.05)。结论PCB118腹腔注射的大鼠甲状腺功能减退、甲状腺组织衰老程度高,甲状腺组织衰老基因p16、p21表达升高,衰老相关分泌表型标志物IL-6 mRNA、TNFαmRNA及MMP13 mRNA表达升高,线粒体线粒体动力学相关蛋白PINK1 mRNA、DNM1L mRNA、MFN1 mRNA表达升高。PCB118可能通过诱导大鼠甲状腺组织线粒体动力学紊乱、上调衰老基因表达、促进衰老衰老相关分泌表型标志物表达,促进甲状腺组织衰老,导致大鼠甲状腺功能减退,诱导大鼠甲状腺衰老。

多氯联苯118对大鼠胰岛素敏感性影响的研究

目的探讨多氯联苯（polychlorinated biphenyl，PCB）118对大鼠胰岛素敏感性的影响。方法将40只清洁级成年雄性Wistar大鼠[体重（200±10）g]按随机数字表法分为4组，每组10只，除正常对照组外，其余3组给予不同剂量PCB118：低、中、高剂量组分别为10、100、1000μg·kg^-1·d^-1，每周腹腔注射5d，造模13周后行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT），计算糖负荷后30min胰岛素增值与血糖增值比值（△I30／△G30）、葡萄糖、胰岛素曲线下面积（AUCg、AUCi）、AUCi／AUCg及稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA—IR）。采用单因素方差分析进行多组间均数比较。结果低、中、高剂量组空腹胰岛素水平[（19．0±7．1）、（18．5±3．1）、（22．1±1．2）mU／L]、30min胰岛素[（55．0±1．9）、（55．0±2．4）、（72．3±1．0）mU／L]及30min血糖水平[（22．32±2．44）、（19．87±1．89）、（21．90±2．88）mmol／L]明显高于对照组[（10．05±3．59）、（25．68±1．27）mU／L、（17．08±1．35）mmol／L]，差异有统计学意义（F值分别为3．622、8．798、7．024，均P〈0．05）；高剂量组60、120min胰岛素水平高于对照组[60min（46．3±1．2）比（18．1±1．1）mU／L，t=3．287，P〈0．05；120min（39．5±1．3）比（24．5±9．4）mU／L，t=2．435，P〈0．05]，各剂量组△I30／AGmAUCi、AUCi／AUCg明显高于对照组（F值分别为15．548、7．130、5．509，均P〈0．05），低、中、高剂量组HOMA—IR亦明显高于对照组（1．26±0．42、1．35±0．22、1．52±0．47比0．65±0．37，F=6．937，P〈0．05），上述指标在各剂量组问比较差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论低剂量PCB118持续暴露可能引起大鼠胰岛素敏感性降低。

多氯联苯118对大鼠甲状腺自身免疫反应的影响

目的探讨多氯联苯118(PCB118)对大鼠甲状腺功能及自身免疫反应的影响。方法Wistar大鼠40只均分为四组:A组为空白对照;B、C、D组分别给予PCB118 10、100、1000μg.kg-1.d-1腹腔注射,每周5次。13周后检测血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白(TG)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、过氧化物酶抗体(TPOAb)水平,甲状腺组织过氧化物酶(TPO)mRNA表达水平,观察甲状腺组织病理学改变。结果甲状腺组织病理学检查显示B、C、D组均可见滤泡腔塌陷、上皮脱落、间质纤维化、小血管增生,B、C组可见间质淋巴细胞浸润。随着PCB118剂量增加,B、C、D组血清FT3、FT4、TG浓度逐渐降低;D组FT3浓度明显低于A、B组(P<0.05);B、C、D组血清FT4、TSH浓度明显低于A组(P<0.05);C、D组血清TG水平明显低于A组(P<0.05)。与A组比较,B、C组血清TGAb、TPOAb浓度显著升高(P<0.05);C组TPO mRNA表达水平明显高于A组(P<0.05)。结论 PCB118可导致大鼠甲状腺组织形态和功能异常,激活甲状腺自身免疫反应。

PCB-118对大鼠胰岛细胞的生长抑制作用

目的观察多氯联苯(PCB)-118对大鼠胰岛细胞INS-1的抑制作用。方法采用不同浓度PCB-118刺激INS-1细胞。MTT法检测INS-1细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测胰岛素相关基因表达水平,以膜联蛋白Ⅴ-碘化丙啶(AnnexinⅤ-PI)双染和Western blot检测INS-1细胞凋亡及相关蛋白表达。结果采用80μmol/L和100μmol/L的PCB-118处理INS-1细胞72h后,INS-1细胞生长显著受到抑制(P<0.01)。与0μmol/L的PCB-118处理比较,50μmol/L的PCB-118处理INS-1细胞72h后,胰岛素基因1(Insulinl 1)、Insulinl 2、胰腺十二指肠同源框因子1(Pdx1)和葡萄糖转运子2(GT-2)的基因表达水平均下调(P<0.05或P<0.01),细胞凋亡率增高(P<0.05)。与0μmol/L的PCB-118处理比较,10μmol/L和50μmol/L的PCB-118处理细胞后,B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达降低,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)剪切体和Bcl-2相关X蛋白(Bax蛋白)表达量增加,Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05或P<0.01)。结论PCB-118可抑制INS-1细胞增殖,降低胰岛细胞功能,并诱导其凋亡;这提示PCB可能与糖尿病发病有关。