我国一株鹦鹉病毒的鉴定及其生化特性

１９９５ 年作者从湖北濒死鹦鹉体内分离到一株新病毒，经鹦鹉胚成纤维细胞盲传四代过渡到鸡胚成纤维细胞，再传至第五代出现细胞病变。适应细胞的病毒纯化后，经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析，发现病毒粒子结构蛋白由８ 条多肽组成，分子量范围在１４ ．５ ～６０ ｋ Ｄ 之间。病毒的酸碱氨基酸之比为２ ．５１ ，富含 Ａｓｐ 、 Ｃｌｕ 和 Ｌｅｕ ，而 Ａｒｇ 和 Ｍｅｔ 含量较少。病毒核酸为双链 Ｄ Ｎ Ａ，存在超螺旋型、环型和线型三种形态， Ｇ＋ Ｃ 的含量为４５ ％ 。经限制性内切酶分析，核酸的分子量为３ ．３ ×１０６ Ｄ。根据病毒分类的标准确认为澳州长尾小鹦鹉幼雏病病毒，应归属于乳多空病毒科多瘤病毒属。

学龄后儿童肾移植后BK多瘤病毒感染的影响因素及其预测模型构建

目的分析影响儿童肾移植术后BK多瘤病毒(BKPyV)感染的相关因素,并构建儿童肾移植术后BKPyV感染的预测模型。方法回顾性收集2014年1月至2022年3月在郑州大学第一附属医院接受同种异体肾移植的332例儿童受者的临床资料。依据BKPyV载量水平,分析不同时间点淋巴细胞的动态变化过程。应用Cox回归模型分析筛查BKPyV感染的相关因素,采用受试者工作特征曲线(ROC)评估预测感染模型的灵敏度和特异度。结果332例患儿中,男215例,女117例;移植年龄(12.2±3.9)岁;学龄前(1~5岁)37例,学龄后(6~18岁)295例。对224例患儿尿液与30例患儿血液样本的BKPyV载量检测结果显示,学龄前BKPyV尿症9例,BKPyV血症3例;学龄后BKPyV尿症76例,BKPyV血症14例。多因素Cox回归模型分析显示,较高体质指数(HR=1.105,95%CI:1.020~1.197)、抗人胸腺细胞免疫球蛋白应用(HR=2.196,95%CI:1.335~3.613)、较高他克莫司浓度(HR=2.484,95%CI:1.298~4.753)、较高自然杀伤(NK)细胞计数(HR=1.193,95%CI:1.009~1.411)、较高CD14^(++)CD16^(-)细胞计数(HR=1.096,95%CI:1.024~1.173)是学龄后儿童BKPyV尿症发生的危险因素;移植肾功能延迟恢复(HR=4.993,95%CI:1.555~16.038)、急性排斥反应(HR=6.021,95%CI:1.930~18.787)、较高CD14^(++)CD16^(-)细胞计数(HR=1.227,95%CI:1.081~1.392)是学龄后儿童BKPyV血症发生的危险因素。ROC曲线分析结果显示,联合体质指数、免疫诱导用药、他克莫司浓度、NK细胞计数、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数预测学龄后儿童肾移植术后0.5、1、2、5年BKPyV尿症发生的曲线下面积(AUC)分别为0.712(95%CI:0.626~0.798)、0.708(95%CI:0.612~0.804)、0.754(95%CI:0.668~0.840)和0.767(95%CI:0.685~0.849),预测模型的灵敏度和特异度分别为64.9%、61.4%、61.6%、55.8%和70.9%、72.4%、76.0%、84.0%。联合移植肾功能延迟恢复、急性排斥反应、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数预测学龄后儿童肾移植术后0.5、1、2、5年BKPyV血症发生的AUC分别为0.791(95%CI:0.631~0.951)、0.744(95%CI:0.547~0.936)、0.786(95%CI:0.629~0.946)和0.812(95%CI:0.672~0.948),预测模型的灵敏度和特异度分别为76.1%、67.1%、75.0%、77.9%和88.9%、89.0%、89.9%、88.0%。结论术后CD14^(++)CD16^(-)细胞水平可作为学龄后儿童肾移植后BKPyV感染的预测因子。联合体质指数、免疫诱导用药、他克莫司浓度、NK细胞计数、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数可预测学龄后儿童肾移植术后BKPyV尿症发生;联合移植肾功能延迟恢复、急性排斥反应、CD14^(++)CD16^(-)细胞计数可预测学龄后儿童肾移植术后BKPyV血症发生。

基于ddPCR的肾移植术后病毒多联检方法构建及评价

目的基于微滴式数字PCR(ddPCR)技术,构建针对肾移植术后监测病毒的多联检测方法,评估其检测性能,探讨临床应用前景。方法构建多瘤病毒1型(BKV)、多瘤病毒2型(JCV)和细环病毒(TTV)联合检测的ddPCR检测方法,对符合率、重复性、检测下限等指标进行性能评价。2023年6—9月在上海交通大学医学院附属仁济医院收集69份临床尿液标本,同时应用实时荧光定量PCR(qPCR)和ddPCR方法进行检测。应用Spearman相关性分析、Bland-Altman分析和Wilcoxon配对秩和检验分析2种方法学的检测结果。结果构建的ddPCR方法对7个参考品的检出符合率为7/7;对精密度参考品R1、R2分别检测10次,其变异系数均小于10%;检测下限为10拷贝/μl。ddPCR与qPCR检测BKV和JCV的符合率达95%(66/69;68/69)以上;相关性分析显示2种方法检测BKV和JCV病毒载量的相关系数R分别为0.874和0.840;Bland-Altman分析显示2种方法对BKV和JCV病毒载量检测的平均差异分别为‒0.34和‒0.187;Wilcoxon配对秩和检验显示2种方法对多瘤病毒的检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建基于ddPCR的肾移植术后病毒多联检测方法,确证该方法具有高正确度、高灵敏度、多重检测的优点,可用于临床尿液样本中BKV、JCV和TTV的定量检测。

WU多瘤病毒在急性呼吸道感染儿童中的检出及初步临床研究

目的了解WU多瘤病毒（WU polyomavirus，WUPyV）在小儿呼吸道感染中的检出情况及感染患儿的临床特点。方法应用PCR技术，对2008年7月至2009年6月广东省汕头大学医学院第二附属医院儿科急性呼吸道感染住院患儿的呼吸道鼻咽抽取液及健康体检儿童呼吸道鼻咽抽取液进行WUPyV核酸检测，阳性结果再进一步基因测序，并分析阳性患儿的临床资料。结果771例患儿中WUPyV阳性15例，阳性率1．95％，其中单纯WUPyV感染9例（60％），合并其他病毒感染的有6例（40％）。82例健康体检儿童WUPyV的PCR检查均阴性。所有WUPyV阳性患儿年龄均≤4岁，最小2个月，最大48个月，平均年龄18．8个月；男：女=1．5：1，临床诊断主要是：支气管肺炎、细支气管炎、上呼吸道感染、支气管炎，其中1例重症患儿合并病毒性脑炎。结论WUPyV可能是呼吸道感染病原体，其主要感染对象是婴幼儿，主要症状是咳嗽和喘息，个别有重症表现。

多瘤病毒基因载量与出血性膀胱炎发生相关性的研究

目的研究多瘤病毒的基因载量与异基因造血干细胞移植出血性膀胱炎发生的关系。预防移植后出血性膀胱炎的发生。方法收集40例健康人和40例异基因造血干细胞移植及20例合并出血性膀胱炎患者的血液和尿液，合成多瘤病毒BKV、JCV和SV40基因引物，应用传统的PCR和EvaGreen染料荧光定量PCR法，分别检测血液和尿液多瘤病毒BKV、JCV和SV40DNA。结果40例健康人和40例异基因造血干细胞移植患者血液中BKV、JCV和SV40基因均为阴性；尿液中正常健康人BKV基因的检出率为15％（6／40），JCV基因的检出率为10％（4／40）。异基因造血干细胞移植患者BKV检出率为100％（40／40），JCV基因的检出率为12％（5／40），SV40基因均为阴性。20例出血性膀胱炎患者尿液中BKV基因载量均高于正常人和无出血性膀胱炎的异基因造血干细胞移植患者。结论正常健康人的泌尿系潜伏存在病毒BKV和JCV基因，异基因造血干细胞移植患者出血性膀胱炎的发生与BKV多瘤病毒DNA的载量有关。

多瘤病毒基因载量与免疫抑制剂剂量相关性的研究

目的研究异基因干细胞移植免疫抑制剂的剂量与多瘤病毒载量的关系，预防移植后出血性膀胱炎的发生。方法收集122例干细胞移植患者的血液和同期尿液及1例移植后连续8个月外周血和同期尿液，提取尿液DNA，合成多瘤病毒BKV基因引物探针，荧光定量PCR法检测病毒基因载量和荧光偏振免疫法测定血液环胞素A浓度，动态观察分析二者之间的关系。结果当血液环胞素A浓度高于86～105ng／ml，尿液BKV—DNA病毒检测阳性，尿液BKV，DNA病毒载量随着血液环胞素A浓度而改变，二者呈线性关系。结论当机体处于免疫抑制状态时BKV病毒-DNA的载量与使用免疫抑制剂的剂量有关，增加了移植后诱发出血性膀胱炎的危险性。

KI和WU多瘤病毒的发现及研究进展

1KIPyV和WUPyV的发现 2007年，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院的科学家Allander等Ⅲ运用大规模分子筛技术从637份小儿下呼吸道感染分泌物和192份粪便中检测出一种新的人类多瘤病毒，并以发现者单位（Karolinska Institutet）命名为“KI多瘤病毒（KI polyomaviruses，KIPyV）”。

地鼠多瘤病毒PCR检测方法的建立

目的建立地鼠多瘤病毒（hamster polyomavirus，HaPyV）PCR检测方法，并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测。方法设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物，以含HaPyV VP1片段的质粒PMDl9T—HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物。以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性。将定量的质粒PMD19T-HaPyV68810倍系列稀释后进行PCR敏感性检测。以小鼠多瘤病毒（murinepolyomavirus，MuPyV）检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性。应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyVDNA检测。结果仅含有质粒PMDl9T—HaPyV688和MuPyVDNA的样品能够扩增出600bp的片段，经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VPl特异基因片段。PCR所能检出的PMD19T—HaPyV688和MuPyV的最少DNA拷贝数分别为5300和590。7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性。结论建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性，可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测。

多瘤病毒BK研究的新进展

自1971年首次报道多瘤病毒家族成员BK病毒(BKV)以来,随着研究的不断深入,已证实BKV跟临床上多种疾病相关。BKV已引起临床上特别是肾移植领域的更多的关注。本文对近5年来对BKV研究的主要新进展作一综述。

Merkel细胞癌多瘤病毒阳性的皮肤原发性Merkel细胞癌二例

目的报道Merkel细胞癌多瘤病毒阳性的Merkel细胞癌2例。方法对诊治的2例Merkel细胞癌进行光镜观察及免疫组化标记，聚合酶链反应（PCR）检测Merkel细胞癌多瘤病毒并测序。结果2例均为男性，例1右下肢胫前肿物1年余，皮肤科检查见右胫前密集粉红色结节，融合成10cmX8cm肿块，质硬，部分表面糜烂伴渗出及结痂，肿块周围亦可见多个大小不一的红色结节，活动性差。例2左膝肿物6月余，皮肤科检查见左膝内侧5cm×4cm紫蓝色结节型肿物，质硬，边界不清，活动性差。2例患者皮损组织病理表现相似，肿瘤细胞大小一致，细胞核大、深染，染色质细腻，核分裂象易见；胞质少，红染。免疫组化：广谱细胞角蛋白（pan—CK）、细胞角蛋白20（CK20）、突触素（Syn）、嗜铬素（CgA）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）均阳性，Ki-67（≥60％）阳性；细胞角蛋白7（CK7）、S100蛋白、HMB45、CD34、甲状腺转录因子1（TTF-1）和白细胞共同抗原（LCA）表达均阴性。2例Merkel细胞癌均经PCR检测到Merkel细胞癌多瘤病毒，而5例皮肤T细胞淋巴瘤、2例正常人皮肤和2例T细胞淋巴瘤细胞系MACl和MAC2A均未检测到Merkel细胞癌多瘤病毒。结论Merkel细胞癌具有特征性的临床和组织病理表现，免疫组化标记、PCR检测Merkel细胞癌多瘤病毒对明确诊断具有重要作用。

进行性多灶性脑白质病的发病机制研究进展

进行性多灶性脑白质病(PML)是由JC多瘤病毒(JCV)引起的一种罕见、致命的中枢神经脱髓鞘疾病,主要发生在免疫系统受损的患者中。JCV的致病变异在PML发病机制中发挥重要作用,包括:(1)JCV非编码调控区(NCCR)基因重组和转录因子结合位点的变化影响基因转录水平;(2)VP1区域核苷酸突变决定了JCV的抗原性和受体特异性,且在细胞吸附、免疫介导和致病性方面起着重要作用。此外,免疫细胞在PML发病中也发挥重要作用。T淋巴细胞能够识别病毒抗原、清除JCV,与PML预后直接相关; B淋巴细胞可以作为JCV潜伏位点,并在病毒传播、复制以及协调转录因子的表达中发挥作用。本文主要从JCV的致病变异和机体免疫两方面对PML的发病机制进行详细阐述。

实时荧光定量PCR检测儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒

目的建立并应用检测儿童下呼吸道感染WU多瘤病毒（WU polyomavirus）的实时荧光定量PCR（real-time fluorescentquantitativePCR，FQ—PCR）方法。方法选择WU多瘤病毒的VP2基因作为检测的目标基因，设计FQ—PCR引物和检测探针，以重组质粒为标准品建立标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价；应用该方法对温州医学院附属温岭医院收集的临床下呼吸道感染患儿的痰液、咽拭子846份及血清标本846份进行定量检测。结果本研究建立FQ—PCR检测方法，质粒标准曲线的方差系数为0．998，灵敏度可达到50拷贝；应用该方法检测700份痰液标本，检测到7例阳性标本，146份咽试子标本中未检测到阳性标本，总阳性率为1．00％（7／700），846份血清标本未检测到阳性标本。结论本研究建立的rQ—PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒进行定量检测；痰液标本较咽拭子或血清标本更适用于WU多瘤病毒感染的核酸检测。

多重实时荧光定量PCR技术检测儿童呼吸道新发病毒方法的建立与应用

目的建立儿童新发呼吸道病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法，并利用该方法进行临床标本的检测。方法根据人类偏肺病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、人博卡病毒、KI多瘤病毒和wu多瘤病毒的保守区域设计并合成引物和探针，确定引物和探针的特异性，优化引物和探针的组合浓度，通过检测具有类似临床症状的其他病原体的标本评价该多重荧光定量PCR方法的特异性，构建质粒标准品用于分析检测该方法的灵敏度和重复性；并对2009至2012年湖州市妇幼保健院及湖州市中心医院收集的322例呼吸道感染患儿的痰液标本进行检测分析。结果成功建立了这6种新发呼吸道病毒的多重荧光定量PCR检测方法，能够同时或分别对其进行检测。体系中筛选的引物和探针具有很好的特异性，并优化出适合的引物探针组合浓度，灵敏度分析最低检测限为10拷贝数／μl，重复性分析中批内变异系数（CV）为1．2％～3．4％，批间CV为0．08％～0．85％，均小于5％。322份临床标本中，人类偏肺病毒阳性17份，阳性率5．28％，人博卡病毒9份，阳性率2．80％，未检到冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒。结论多重荧光定量PCR方法具有简单快速，灵敏性和特异度高等特点，并且能实现多种新发病毒同时并行检测，可为儿童呼吸道新发病毒感染的临床诊治提供技术支持。