多粘类芽孢杆菌Cp-S316抗真菌活性物质的提取及其部分性质研究

多粘类芽孢杆菌Cp-S316对动植物真菌、细菌病原物具有广谱抗性,为研究抗真菌活性物质的化学结构、理化性质并探讨其工业化生产的可行性,研究了大孔吸附树脂对多粘类孢杆菌Cp-S316产生的抗真菌活性物质的吸附、解吸性能,筛选出其最佳解吸剂,并测定了抗真菌活性物质的部分性质。结果表明,大孔吸附树脂X-5对抗真菌活性物质的吸附及解吸性能最好,其饱和吸附量为5.36×104μg·g^(-1),其最佳解吸剂为0.01mol·L^(-1)HCl-70%乙醇,以解吸剂∶树脂=2∶1(v∶m)进行静态解吸,解吸率达93.28%。该活性物质对热、紫外线稳定,对胰蛋白酶、蛋白酶K有一定的耐受性,对氯仿部分敏感,对酸稳定,对碱敏感。抗真菌活性物质提取方便、理化性质稳定,显示了一定的应用和开发前景。

多粘类芽孢杆菌CP7β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表达及应用

【目的】克隆多粘类芽孢杆菌(Paenibaccillus polymyxa)CP7的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,构建高效表达工程菌株,为CP7菌的抗菌活性组分研究和开发利用以及葡聚糖酶在农业生产中的应用提供理论依据。【方法】通过CP7菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及原核表达构建工程菌株,采用平板对峙培养和生长速率测定法研究重组酶对供试真菌的生长抑制活性,同时采用体外消化法研究该酶对麦类饲料消化率的影响。【结果】成功克隆目的基因并在原核系统获得高效表达。重组酶蛋白对4种供试真菌菌丝生长具有明显抑制作用,平均抑制率高达40%以上;添加了重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的处理组样品,经体外消化后黏度降低了4.69%(P﹥0.05)。【结论】β-1,3-1,4-葡聚糖酶是CP7菌发酵液中抗真菌活性组分或其中之一,对真菌生长抑制的活性作用提示其可作为农业抗病虫害新型药物进行开发研究;该酶能够有效降低麦类饲料黏度,表明其作为饲料添加剂的开发利用同样具有良好前景。

多粘类芽孢杆菌S960对番茄生长与光合生理特性的影响

为研究多粘类芽孢杆菌S960对番茄植株生长和枯萎病防治效果,将多粘类芽孢杆菌S960进行不同倍数稀释(0.5×、10×、50×、100×、500×)对番茄幼苗连续灌根4次(每周1次),满28 d后,测定植株倒数第4片叶片叶绿素含量、气体交换常数及叶绿素a荧光动力学参数,同时测定植株地上生物量、根系生物量、株高、茎周长、枯萎高度占株高比例、叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量等指标。结果表明:与对照组比较,多粘类芽孢杆菌S960灌根使用后,番茄叶绿素a、PN、植株地上生物量、根系生物量、株高、茎周长均显著(P<0.05)升高,而枯萎高度占株高比例显著(P<0.05)降低,其中10×稀释的处理最明显; PIabs明显升高,而其他荧光动力学参数指标变化不大;叶片丙二醛含量显著(P<0.05)降低,可溶性糖和可溶性蛋白含量无显著(P>0.05)变化。因此,多粘类芽孢杆菌S960能促进番茄植株生长,对枯萎病有一定的防治效果,以10×稀释(3.55×10~7cfu/mL)效果最佳。

Cp-S316菌株发酵培养基的优化及其对烟草赤星病菌的抑制作用

通过单次单因子试验和正交试验,对Cp-S316菌株抗真菌活性物质的发酵培养基进行了优化,获得适合菌株生长和抗真菌活性物质产生的最佳培养基配方为:土豆100g、乳糖40g、蛋白胨15g、硝酸钠0.5g、硫酸镁2g、水1L。经摇瓶发酵试验,发酵液效价比基础培养基配方提高了325.24%。Cp-S316菌株产生的抗真菌活性物质粗提物对烟草赤星病菌菌丝具有强烈的抑制作用,采用抑制菌丝生长速率法测定了其对烟草赤星病菌的抑制中浓度为EC50=0.248mg·mL-1;显微镜下观察发现,活性物质能够引起菌丝原生质凝集。

Paenibacillus polymyxa CP7菌抗革兰氏阴性菌活性组分的分离和结构分析

【目的】分离和纯化Paenibacillus polymyxaCP7菌抗革兰氏阴性菌的活性组分,并鉴定其结构。【方法】采用固相萃取柱分离、阳离子交换层析、凝胶过滤层析和HPLC层析等技术对活性组分进行分离纯化,通过紫外-可见光谱、圆二色光谱、红外光谱和MALDI-TOF-TOF-MS质谱对所分离组分进行结构鉴定。【结果】从CP7菌发酵液中分离获得抗革兰氏阴性菌的B、C1和C2组分,分子量分别为1155、1169和1191D。并确定了C1组分的分子式为C53H100O13N16,结构由6个L-α,β-二氨基丁酸(DAB)、2个苏氨酸和2个亮氨酸组成,与多粘菌素E1的结构相同。【结论】从CP7菌发酵液中分离获得了3种抗革兰氏阴性菌的小分子多肽。经测试确认C1组分为多粘菌素类E1。推测B组分也是多粘菌素类的1个成员,而C2组分则可能是多粘菌素家族中的一个新成员。

Cp-S316菌株抗细菌活性物质对大肠杆菌的抑制作用及高产突变株选育

通过测定大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)菌悬液的OD260的变化,研究了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)Cp-S316抗细菌活性物质对其细胞膜完整性的影响,结果表明Cp-S316抗细菌活性物质可损伤大肠杆菌K12的细胞膜,从而引起胞内RNA、DNA等大分子物质的泄漏。为获得抗细菌活性物质高产菌株,以Cp-S316为出发菌株,通过紫外诱变以及对自身产生的抗细菌活性物质的抗性筛选法进行预筛、摇瓶初筛和复筛,获得突变株多粘类芽孢杆菌A17,其发酵效价比出发菌株Cp-S316提高91%,该突变株的高产遗传性状稳定。

一株产胞外多糖植物内生菌EJS-3菌株的分离和鉴定

从中药植物—百部的组织中分离到一株高产胞外多糖的植物内生菌EJS-3菌株,该菌株在产糖培养基中可以得到23.6g/L的胞外多糖,转化率为47.2%(gEPS/g蔗糖)。通过16SrRNA基因序列分析对该菌株进行了鉴定。通过PCR扩增,得到1450bp的16SrRNA序列。PCR产物序列通过BLAST软件在NCBI网站中进行同源性比较。通过Bioedit7.0和Treedrawing软件绘制系统发育树。结果显示,EJS-3的16SrRNA序列和数据库中的类多粘芽孢杆菌KCTC1663菌株的序列的同源性为99.31%。在细菌系统发育分类学上,EJS-3菌株归属多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。

CP7菌株的抗菌活性及菌种鉴定

经分离、筛选获得一株高效分泌抗菌物质的CP7菌株,从该菌株中提取的抗菌产物,对大肠杆菌标准株、金黄色葡萄球菌标准株、苏云金杆菌等细菌;瓜类炭疽病菌、水稻纹枯病菌等真菌有较好的抑菌作用。用16S rDNA序列分析法进行生物分子的分类,该菌株16S rDNA序列与类芽孢杆菌属的34个细菌的同源性为96%~99%,与多粘类芽孢杆菌的同源性为99%。用传统细菌学的方法对CP7菌株进行鉴定,其形态特征、生理生化特性与多粘类芽孢杆菌的特征特性相一致。表明CP7菌株属于多粘类芽孢杆菌。

生防细菌BRF-1和BRF-2鉴定及生物学特征

BRF-1和BRF-2是从大豆根际土壤中筛选得到的两株革兰氏阳性生防细菌,平板对峙培养表明它们对7种植物病原真菌具有拮抗作用。BRF-1芽孢球型中生,无鞭毛;而BRF-2芽孢球型端生,周生鞭毛。部分生物学特征研究表明,两菌株之间存在较大的差异。采用Biolog微生物自动鉴定仪鉴定和对两菌株的16S rDNA基因序列分析表明,菌株BRF-1和BRF-2分别与多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌亲缘关系最近,故把菌株BRF-1和BRF-2分别定为多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

固定化高效苯胺降解菌的制备及处理苯胺印染废水的研究

用苯胺作为唯一的碳源和氮源,从某印染废水处理厂的污泥中通过驯化培养分离出一株高效苯胺降解菌,命名为JHX-8。依据菌落形态、理化特性以及16S rDNA序列测定,将菌株确定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。对该菌株以不同材料进行固定化,考察固定化后菌株对苯胺降解率的影响,结果表明,聚乙烯醇-硅藻土载体中的菌株JHX-8对苯胺的降解率最高。通过考察培养条件,如苯胺质量浓度、培养温度和初始pH对苯胺降解率的影响,确定最佳培养条件为:苯胺最大耐受质量浓度2 000mg/L、培养温度30℃、初始pH=7.0时,对苯胺的降解率高达99.48%。在印染废水的实际处理方面,通过固定化菌株JHX-8对印染废水的应用研究表明应用到处理苯胺印染废水中前景可观。