绵马酚抑制多粘菌素耐药关键蛋白MCR-1的机制研究

mcr-1是近几年发现的一种多粘菌素耐药基因,该基因可随质粒在不同菌株间快速传播,目前已在多个国家及地区被检出,本研究团队前期筛选发现联合使用绵马酚与多粘菌素时可以抑制mcr-1阳性大肠杆菌的生长。为了评价两者联合使用时的抑菌效果,本研究采用棋盘稀释法对mcr-1阳性大肠杆菌进行了绵马酚与多粘菌素联合药敏实验,结果显示,当联合使用绵马酚与多粘菌素时相比单独使用多粘菌素时,多粘菌素的MIC由8μg/m L降低至1μg/m L,FIC指数小于0.5,二者属于协同作用。以终浓度为32μg/m L绵马酚与10μg/m L多粘菌素联合使用,进一步通过平板计数和透射电镜检测其杀菌效果和大肠杆菌菌体的破损程度,结果显示,当联合使用绵马酚与多粘菌素时,大肠杆菌在2 h^8 h逐渐全部死亡,大肠杆菌菌体破损最严重;但不管是单独使用绵马酚还是多粘菌素,大肠杆菌均不能被彻底杀灭。采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法分别提取mcr-1阳性大肠杆菌JD08菌株和含有16μg/m L的绵马酚的mcr-1阳性大肠杆菌JD08菌株中类脂A,利用质谱仪检测类脂A的结构,结果显示在绵马酚存在的情况下,MCR-1蛋白的作用受到抑制,发生转移的酰基键含量大大减少。采用双酶切法构建PET-28a-mcr-1重组表达载体,经诱导表达后通过镍柱亲和层析纯化得到MCR-1蛋白,利用Biacore大分子作用仪验证绵马酚与重组MCR-1蛋白的相互作用,结果显示绵马酚与MCR-1蛋白之间的亲和力为1.47μmol/L,属于直接结合。表明单独使用绵马酚对mcr-1阳性大肠杆菌无效,但其与多粘菌素联合时则产生了良好的抑菌及杀菌效果,绵马酚是MCR-1的小分子抑制剂。本研究首次确认了绵马酚是MCR-1的小分子抑制剂,对于开发新型抗多粘菌素耐药菌的药物具有重要意义。

浙江省23家医院血流感染患者多粘菌素耐药基因mcr-1流行情况

目的 研究浙江省大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌引起的血流感染患者中多粘菌素耐药情况及mcr-1基因流行情况.方法 从2014年3月至2015年4月,收集来自浙江省11个市23家医院引起血流感染的大肠埃希菌（611株）和肺炎克雷伯菌（258株）共869株.微量肉汤稀释法和E-test法分别检测多粘菌素及其他抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）;PCR法检测多粘菌素耐药基因mcr-1及mcr-1阳性菌株的其他耐药基因;脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）分析阳性菌株的亲缘关系;S1-PFGE联合Southern印迹杂交定位mcr-1基因.结果 共发现6株多粘菌素耐药大肠埃希菌（3株MIC为8 μg/ml,3株MIC为16 μg/ml）,且6株菌株均为mcr-1阳性,耐药率及mcr-1检出率为0.69%;未发现多粘菌素耐药或mcr-1阳性肺炎克雷伯菌.PFGE结果显示6株菌株均为非同源性,MLST结果显示6株菌株均为不同的ST型.Southern印迹杂交表明mcr-1基因分别定位在约33 kb、61 kb和244.4 kb不同大小质粒上.结论 mcr-1在浙江省血流感染患者中流行率低,仅为0.69%,且介导低水平的多粘菌素耐药（MIC 为8 ~16 μg/ml）.mcr-1阳性大肠埃希菌通常为非ST131型克隆,同时对其他多种类型抗生素敏感,且并不影响感染患者的预后.需要进行更深入的研究来探明mcr-1基因在临床上的地位.

2016年中国26个省市食源性沙门菌耐药性特征分析

目的了解2016年中国26个省、直辖市和自治区食源性沙门菌的耐药状况。方法采用微量肉汤稀释法测定755株食源性沙门菌对10类16种抗生素的药物敏感性,采用实时荧光定量聚合酶链式反应方法检测mcr-1基因的存在情况。结果 72.7%(549/755)的沙门菌对受试的16种抗生素呈现不同程度的耐药性,其中萘啶酸(NAL)、四环素(TET)、氨苄西林(AMP)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)4种抗生素的耐药率较高,均在34%以上,未见碳青霉烯类[亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)]耐药菌株,44.4%(335/755)的沙门菌同时耐受3类或3类以上抗生素,表现为多重耐药,同时耐受抗生素种类最高为8类。共存在134种耐药谱,优势耐药谱型为NAL、TET和AMP-SAM-NAL。全部菌株中检出2株携带mcr-1基因的菌株,分别为八重耐药的德尔卑沙门菌(Salmonella Derby)和七重耐药的鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)。部分省份沙门菌耐药率较高。结论 2016年中国26个省、直辖市和自治区食源性沙门菌整体耐药水平较高,多重耐药情况严重,我国食源性沙门菌中存在携带mcr-1基因的多重耐药菌株,应引起关注。

浙江省东阳地区大肠埃希菌mcr-1的检测及流行病学研究

目的研究浙江省东阳地区临床分离大肠埃希菌多粘菌素耐药现状和质粒介导多粘菌素耐药基因mcr-1的携带情况，了解携带mcr-1的大肠埃希菌菌株流行特征，为当地临床医生防控mcr-1携带菌株的扩散和传播提供理论依据。方法收集浙江省东阳市人民医院2016年1月至12月临床分离的非重复315株大肠埃希菌，所有菌株分离自血液、尿液和呼吸道标本等。采用PCR检测质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1、β-内酰胺酶和碳青霉烯类耐药基因；微量肉汤稀释法测定抗生素对mcr-1阳性菌株的最低抑菌浓度；采用接合试验检测mcr-1基因是否位于可转移质粒上；通过多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）对mcr-1阳性菌株进行分子分型。结果在315株大肠埃希菌中，共5株检测出mcr-1，阳性率为1.6%。5株mcr-1阳性大肠埃希菌中，2株同时检测到β-内酰胺酶耐药基因，均为blaTEM-1和blaCTX-M-14，此2株大肠埃希菌对一、二、三代头孢菌素均耐药，仅1株对头孢吡肟耐药。所有5株mcr-1阳性大肠埃希菌对环丙沙星及左氧氟沙星均敏感，对替卡西林/克拉维酸均耐药。未检测到碳青霉烯类耐药基因。5株mcr-1阳性大肠埃希菌接合成功1株。MLST分型结果显示有4种ST型，其中ST131型有2株，ST43、ST69、ST349各1株。结论多粘菌素耐药基因mcr-1在浙江省东阳地区临床分离的大肠埃希菌中检测率较低，仅为1.6%，说明该基因在东阳地区还没有形成流行趋势，只是零星散发式存在。但已经发现mcr-1基因与β-内酰胺酶耐药基因共存的现象，提示临床应加强对抗生素使用的控制，防止多重耐药菌株的扩散。