基于质量编码探针的质谱多联检测研究进展

质量编码探针是一类以质量标签分子对待测物进行特异性识别标记并输出其特征离子信号的探针工具,其在疾病标志物多元分析和药物靶点筛选等方面都发挥着重要的作用。近年来,研究者基于各类质谱分析方法,开发了不同结构与功能的质量编码探针,为生理环境中生物分子的多重检测以及组织样本的质谱成像提供了有力的技术工具。本文从探针结构组成、质谱分析方法以及在生化分析中的应用3个方面综述了质量编码探针在质谱多联检测方面的最新研究进展,并对其未来的发展方向进行了展望。

牛奶中头孢类药物残留的HPLC多联检测方法

采用高效液相色谱法(HPLC),建立了可同时检测牛奶中头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩药物残留量的多联检测方法。样品经超声波振荡,先后加入乙腈除蛋白,正己烷去除脂肪,经0.45μm和0.22μm有机超滤膜过滤,使用Agilent-C18反相色谱柱,以甲醇和0.1%甲酸溶液为流动相(V∶V=4∶6),流速为1 m L/min,柱温35℃,检测波长为254 nm。该方法对头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩4种头孢类药物的检出限均为1.0μg/kg,在质量浓度为1.0~50.0μg/L范围内具有良好线性关系,相关系数达到0.999,回收率为90%~105%,批内相对标准偏差≤15%,批间相对标准偏差≤20%。本方法具有分析时间短、检测限低、精密度高、多联检测的优点,对于准确监控牛奶中头孢类药物残留量具有重要意义。

移植术常见病原体检测的多联qPCR法的建立与初步应用

目的 探讨多联实时荧光定量PCR(qPCR)应用于移植术中常见病原体检测的有效性。方法 选择临床移植术后常见的24种感染病原体,设计qPCR检测体系的引物探针序列,以每种病原体的标准质粒做qPCR反应验证;优化本实验中每种病原体反应体系的引物探针效果及浓度,分析确定qPCR方法的灵敏度、相关系数(R^(2))、扩增效率(E)后,用四川省人民医院移植ICU提供的肝肾移植患者标本22例做检测体系的应用验证:提取标本的总核酸100μL/(人)份,均分为二,分别以多联qPCR反应体系检测,以高通量测序方法(NGS)分析微生物种类;同时对移植患者的标本2 mL/份做微生物培养法检测。比较3种检测方法的检测结果,将NGS法作为金标准,分析多联qPCR法的阳性检出率,及其与培养法和NGS检测结果的差异。结果 所建立的qPCR检测体系24种病原体的qPCR检测下限均达到10^(1)cp/μL,均为R^(2)>0.99;对临床肝肾移植患者标本的病原体阳性检出率59.1%(13/22),NGS法相应为63.6%(14/22)(P>0.05)、微生物培养法为18.2%(4/22)(P<0.05)。检出的病原体比例:人类疱疹病毒6型(HHV-6) 30.8%(4/13)、巨细胞病毒(HCMV) 23.1%(3/13)、EB病毒(EBV)23.1%(3/13)、人细小病毒B19 15.4%(2/13)、流感嗜血杆菌(Hin)15.4%(2/13)、屎肠球菌(Efm)15.4%(2/13)、艰难梭菌(Cd)15.4%(2/13)、大肠杆菌(Eco)7.7%(1/13)、嗜麦芽窄食单胞菌(Sma) 7.7%(1/13)、肺炎克雷伯菌(Kpn)7.7%(1/13)、粪肠球菌(Efa)7.7%(1/13)、肺炎链球菌(Spn)7.7%(1/13)。3种方法的病原体检出一致率32%(7/22),其中多联qPCR法和NGS法的一致率为59%(13/22)和培养法的一致率41%(9/22)。结论 相较于微生物培养法,多联qPCR法对临床移植术中常见病原体的检测灵敏度高、定量准确、用时短、成本低;多联qPCR法结合NGS法、培养法有助于临床快速判断患者移植术后病原体感染状况。

H1、H3、H9亚型禽流感病毒多联RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的H1、H3、H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列,通过多序列对比,在保守区域内设计了3对特异性引物,对PCR反应体系的各组分进行试验调整,建立了一种H1、H3、H9亚型AIV多联RT-PCR检测方法,在2h内即可判断待检样品中是否有这3种亚型AIV的存在。经灵敏性及特异性试验以及临床样品检测结果证明,该方法灵敏度高、特异性好、结果准确,能够作为H1、H3、H9亚型AIV的快速检测方法。

HCV及HIV二联病毒核酸荧光PCR检测方法的建立

目的建立多联病毒核酸荧光PCR检测方法,为我国核酸检测技术的应用前景提供技术支持。方法使用逆转录实时荧光PCR定量方法(QRT-PCR)检测HCV、HIV病毒,在成功扩增定量单一病毒的基础上,通过主要调整Mg(2+)离子、dNTPs、Taq的浓度等优化反应体系,建立同时检测两种病毒核酸的逆转录实时荧光PCR定量检测方法(一步法双检),并分析双检体系的扩增灵敏度。结果通过优化筛选反应条件,使用QRT-PCR方法成功扩增双模板HCV/HIV RNA,且检测特异性好,灵敏度较高,能达到HCV RNA 20IU/ml与HIV RNA 80IU/ml的检测灵敏度。结论本试验成功建立能同时检测两种病毒核酸的QRT-PCR方法,为后续研究HBV、HCV、HIV多联荧光病毒核酸检测系统提供了理论依据与技术支持。