烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶(endo polygalacturonases,endoPGs)是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框(ORF)长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作(接种)之后该基因的表达与未互作(不接种)的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA的克隆和序列分析

以甜瓜品种河套蜜瓜成熟果实mRNA为模板,经反转录合成和PCR扩增得到编码多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因全长cDNA,将其克隆于pUC19质粒中获得重组质粒pCMPG.此cDNA长1183bp,包括一个393个氨基酸残基组成的开放阅读框架.与已报道的甜瓜PG基因cDNA核苷酸序列比较同源性为99.3%,相应的氨基酸的同源性为98.5%.

核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性。目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PG IP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体。本研究以核盘菌的PG cDNA为模板,经PCR扩增获得1 125 bp片断,进一步将其克隆到pEASY-T1载体上。以克隆了目的基因的pEASY-T1质粒为模板,用含NdeⅠ和SalⅠ位点的引物对PG-F2/PG-R2扩增获得1 125 bp大小的目的片段,将其连接到pEASY-T1上生成pEASY-PG。用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-PG,回收1 125 bp片段并连接到诱饵载体pGBKT7相应的酶切位点上,转化大肠杆菌菌株DH5α。在含有卡那青霉素的LB平板上筛选获得重组质粒。经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后获得预期的1 125 bp DNA片段,表明诱饵蛋白载体pGBKT7-PG6构建成功。应用醋酸锂介导法将pGBKT7-PG6转化酵母菌株Y187,经激活培养基上培养检测,未发现蓝色菌落,表明酵母转化子自身不具有自激活功能,可用于大规模筛选经核盘菌诱导的cDNA表达文库。

草莓多聚半乳糖醛酸酶基因RNAi植物表达载体的构建及表达鉴定

从草莓叶片中克隆到多聚半乳糖醛酸酶基因的1个281bp片断,构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体,经测序证实连接正确后,克隆到植物表达载体p2300121中的GUS基因位置并经双酶切证实,得到RNAi表达载体。采用直接转化法将PG2300121导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经PCR方法鉴定,证实了该基因已导入烟草基因组中。

果实成熟与多聚半乳糖醛酸酶基因的研究进展

对与果实成熟相关基因多聚半乳糖醛酸酶 (PG)基因的筛选、鉴定。

利用多聚半乳糖醛酸酶反义基因转化选育耐贮中国樱桃

目的:利用多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因转化选育耐贮中国樱桃。方法:以2个中国樱桃品种为实验材料,研究了激素浓度、叶片生理状态、光照条件等因素对叶片再生的影响,建立了中国樱桃叶片培养高频再生体系。以继代生长40d左右的组培苗顶部充分展开的叶片为外植体,整片放在含6-BA1.5mg/L、IBA0.5mg/L、KT0.5mg/L和腺嘌呤30mg/L的MS分化培养基上,在适宜的光照和处理条件下,芽分化率高达80%以上。以上述叶片为受体,用含有PG反义基因的农杆菌进行侵染。结果:经PCR和PCR-Southern检测证明PG反义基因已整合进樱桃核基因组中。结论:以培养的叶片为受体,用农杆菌介导法进行转基因在中国樱桃上是可行的。

龙眼多聚半乳糖醛酸酶基因DlPG1表达模式与幼果脱落关系研究

从龙眼中分离获得1个多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因,命名为DlPG1。DlPG1基因与多种物种PG基因氨基酸序列有较高的同源性,其中与同属于无患子科的荔枝同源性最高,为95%,且与荔枝的亲缘关系最近。DlPG1基因包含PG基因特有4个保守区中的3个,DlPG1属于E进化支PG基因家族成员。环剥摘叶处理可以显著促进龙眼幼果脱落,对照累积落果率为6.12%,处理为89.85%,相对落果率高峰出现在处理后第5天。处理的离区DlPG1基因表达量始终高于对照,且表达量高峰出现在处理后第4天。基因表达量的高峰早于相对落果率高峰出现,据此推测,DlPG1基因可能是调控龙眼幼果脱落的关键基因。截至目前,DlPG1基因是首例在龙眼中发现的属于E进化支的可能与器官脱落相关的PG基因。

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因反义表达载体的构建

本实验用设计好的两条 75bp的长引物进行PCR反应 ,扩增出甜瓜PG1基因的 12 8bp的片段 ,将其克隆到pMD18-T载体中 ,筛选反向克隆 ,然后将其反向构建到植物表达载体 pUC38-ACC的CaMV35S启动子和TMV增强子“Ω”的下游 ,构建成反义表达载体 pUC38-PG。用PCR鉴定重组子 ,并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体 ,为用花粉管法将其导入河套蜜瓜 。

水稻纹枯病菌多聚半乳糖醛酸酶基因RsPG5的克隆与功能分析

【背景】纹枯病是水稻最重要的病害之一,目前对其病菌致病机制的研究还较少。【目的】鉴定更多水稻纹枯病菌致病基因,为纹枯病的防治提供理论依据。【方法】采用3′-RACE方法获得RsPG5基因全长,并使用ExPASy等在线软件对其编码产物的结构及生物学特性进行分析,测定其编码产物的致病功能。【结果】RsPG5具有7个外显子和6个内含子,编码区全长1263 bp,可编码420个氨基酸。编码产物为糖苷水解酶GH28家族成员,具有真菌多聚半乳糖醛酸酶特有的保守序列NTD、DD、GHG和RF(I)K,并且有一个含15个氨基酸的信号肽;二级结构由α-螺旋、β-折叠和随机卷曲螺旋构成,并且可形成4个二硫键;三级结构为由α-螺旋、β-折叠和随机卷曲螺旋按右手螺旋规则形成的具有裂隙区的特定空间结构,裂隙区可能负责着其酶活功能。生物学性质预测表明,RsPG5为稳定、易溶于水的外泌性蛋白,主要定位于细胞壁、液泡和线粒体。RsPG5具有明显的多聚半乳糖醛酸酶活性,可分解果胶,破坏水稻叶鞘细胞;针刺接种分蘖末期水稻叶鞘,72 h后可形成明显的褐色坏死斑;将纹枯病菌接种至水稻叶鞘,在病菌致病过程中RsPG5可上调表达。【结论】RsPG5是一个典型的多聚半乳糖醛酸酶蛋白,为水稻纹枯病菌的重要致病因子。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)多聚半乳糖醛酸酶基因(BpPG),并阐明Bp PG基因在B.pyrrocinia JK-SH007定殖中的生物学功能。【方法】通过设计特异性引物(PG-F、PG-F)克隆Bp PG基因,并对其全长基因进行生物信息学分析;采用MEGA 5.0软件进行系统发育树分析;将B.pyrrocinia JK-SH007接种杨树,利用实时荧光定量PCR方法,分析Bp PG基因在B.pyrrocinia JK-SH007定殖过程中的差异表达。【结果】Bp PG基因全长2 001 bp,编码666个氨基酸,预测蛋白质分子量69.23 ku,理论等电点为8.37;Bp PG蛋白有6个蛋白质结合位点,属于Glycosyl hydrolases family 28家族,为亲水性蛋白,不具有信号肽。二级结构主要包括α-螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲,三级结构预测结果与二级结构相符。系统进化分析表明,Bp PG与PG(Gen Bank序列号WP 034181566.1)具有同源性。实时荧光定量PCR结果显示B.pyrrocinia JKSH007定殖过程中,不同时期的Bp PG基因表达量存在差异。【结论】克隆得到Bp PG基因,Bp PG基因在进化上是保守的,其极有可能在B.pyrrocinia JK-SH007定殖过程中发挥作用。

苹果PGIP基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究

为了验证苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因表达产物对植物病原真菌的作用,获得转基因植株,培育抗病新品种,本研究用限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ将已克隆的苹果PGIP基因从克隆载体pMD-18T上切下,定向插入到植物表达载体pWR306的ED35s启动子和TNOS终止子中间,成功构建了苹果PGIP基因植物表达载体pWR306-PGIP及工程农杆菌,以番茄中蔬四号叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法转化,获得了8株PCR检测阳性的番茄植株。

烟草PGIP基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据Gen Bank数据库报道的林烟草(Nicotiana sylvestris)PGIP基因c DNA序列,设计特异性引物,从普通烟草(Nicotiana tabacum)种植品种小黄金中分离得到了其g DNA序列,分析结果发现烟草PGIP基因没有内含子序列。信号肽分析结果表明,烟草PGIP基因含有一段长28个氨基酸的信号肽。将去除信号肽的烟草PGIP基因片段亚克隆至枯草芽孢杆菌表达载体p HT43中,转化枯草芽孢杆菌菌株WB600并进行IPTG诱导。SDS-PAGE电泳表明,重组菌株可成功表达目的蛋白质,分子质量符合预期大小;琼脂扩散试验结果发现,表达的烟草PGIP蛋白质能够明显抑制辣椒疫霉PGs的活性。

转耐贮藏基因遗传工程番茄田间试验

田间试验结果表明 ,转多聚半乳糖醛酶基因的耐贮藏番茄 ,产量和贮藏期极显著地高于未转基因的番茄。这一科技成果的应用克服了热区番茄不耐贮藏的问题 ,满足了热区淡季蔬菜市场的需求。

莲腐败病菌pg基因的克隆及真核表达分析

针对尖孢镰刀菌莲专化型引起的莲腐败病是对白莲产业威胁最大的一种毁灭性病害。在植物病原菌侵染寄主植物引起病害的过程中多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)起着关键作用,是重要的致病因子。实验通过RT-PCR和RACE方法对莲腐败病菌的pg1全长cDNA进行克隆,获得一个编码371个氨基酸的完整开放阅读框。通过毕赤酵母表达系统成功构建了PG1同工酶的真核表达载体,利用甲醇诱导分泌出胞外蛋白PG1,分子量大小约为38 ku,与之前预测的分子量大小一致。研究结果为进一步分析PG基因的功能、探讨该基因在病原菌浸染过程中的作用机理和莲腐败病的防治提供了科学依据。

果实软化相关PG基因的进化分析和基因组定位

利用NCBI数据库和蔷薇科基因组数据库中的数据对48个果实PG基因进行系统进化分析,结果表明3个进化支中都包含与果实软化相关的PG基因,属于A支和属于B支的PG基因有明显的功能差异。氨基酸序列分析显示,3个进化支中的PG基因存在多个差异位点,A支和C支PG基因的N端比B支短60~70个氨基酸。PG基因结构（包括启动子、内含子和编码区）的变异对其功能差异有重要影响。对苹果和桃的PG基因进行了基因组精确定位,其附近存在果实软化相关性状标记。