利用多聚半乳糖醛酸酶反义基因转化选育耐贮中国樱桃

目的:利用多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因转化选育耐贮中国樱桃。方法:以2个中国樱桃品种为实验材料,研究了激素浓度、叶片生理状态、光照条件等因素对叶片再生的影响,建立了中国樱桃叶片培养高频再生体系。以继代生长40d左右的组培苗顶部充分展开的叶片为外植体,整片放在含6-BA1.5mg/L、IBA0.5mg/L、KT0.5mg/L和腺嘌呤30mg/L的MS分化培养基上,在适宜的光照和处理条件下,芽分化率高达80%以上。以上述叶片为受体,用含有PG反义基因的农杆菌进行侵染。结果:经PCR和PCR-Southern检测证明PG反义基因已整合进樱桃核基因组中。结论:以培养的叶片为受体,用农杆菌介导法进行转基因在中国樱桃上是可行的。

多聚半乳糖醛酸酶反义基因在转基因番茄中的表达

番茄的多聚半乳糖醛酸是一种在果实成熟阶段特异性表达的酶。为了研究它在果实成熟中的作用，将其ｃＤＮＡ与花椰菜花叶病毒３５５启动子嵌合后，以反义基因的形式经农杆菌介导导入番茄植株，进一步分析了反义基因的整合与表达。结果表明，在转基因番茄中，反义基因的表达能明显抑制果实内源多聚半乳糖醛酸酶的活性。

多聚半乳糖醛酸酶反义基因转化加工番茄

利用农杆菌EHA105介导转化,将PG基因转入加工番茄B04植株。通过对影响外植体转化的因素(预培养时间、侵染时间、农杆菌浓度、共培养时间)进行了深入探讨,建立了加工番茄品种B04子叶外植体的高频遗传转化体系,并通过农杆菌介导法将PG反义基因导入加工番茄品种B04,获得PG抗性植株。其最佳预培养时间为2天;当农杆菌的菌液浓度为OD600=0.6、侵染时间为10 min时转化率最高;其最佳的共培养时间为2天。对获得的41株抗卡那霉素转基因植株进行PCR检测,其中9株为阳性植株,其转化率为22%。初步证实了部分加工番茄B04植株中已导入PG反义基因。

青花菜多聚半乳糖醛酸酶基因BoPGX3的克隆及盐胁迫下的表达特征分析

多聚半乳糖醛酸酶(PG)可降解细胞壁,从而降低植物抵抗能力。为了解青花菜PG基因响应盐胁迫的分子机制,以青花菜自交系‘WN12-95B’为试验材料,提取青花菜的总RNA并合成cDNA,克隆PG基因,并检测其在盐胁迫下的表达特征。结果表明:青花菜BoPGX3基因序列全长1476 bp,推导编码491个氨基酸,相对分子量为53.44 kD,等电点为5.84。系统进化分析表明,青花菜BoPGX3与羽衣甘蓝、甘蓝、白菜、萝卜和花椰菜的PG基因亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,BoPGX3基因受盐胁迫诱导表达,处理3 h后相对表达量达到初始表达量的2.9倍,处理12 h时相对表达量下降至初始表达量的1.4倍。综上,青花菜BoPGX3基因参与了盐胁迫的响应,并可能在此过程中发挥着重要的作用。

莲腐败病菌多聚半乳糖醛酸酶Fcpg1基因功能研究

【目的】共享镰刀菌(Fusarium commune)侵染莲引起的莲腐败病严重影响莲的生产,鉴定莲腐败病菌中多聚半乳糖醛酸酶基因Fcpg1,分析其在生长发育及致病过程中的作用,为进一步研究共享镰刀菌的致病机理及莲腐败病菌的防治提供依据。【方法】利用BLASTP在莲腐败病菌全基因组数据中查找PG同源蛋白,并使用ExPASy等在线软件对Fcpg1氨基酸序列进行生物信息学分析。通过基因敲除的方法,获得Fcpg1基因敲除突变体ΔFcpg1和回补菌株ΔFcpg1-Com。测定野生型菌株FCN23、突变体ΔFcpg1和回补菌株ΔFcpg1-Com的菌落形态、生长速率、产孢量及致病力。【结果】Fcpg1基因编码388个氨基酸,分子量为40.354 ku,分子式为C_(1756)H_(2775)N_(489)O_(577)S_(12),理论等电点为6.57,脂溶系数为79.9。Fcpg1为稳定的、易溶于水的外泌性蛋白,其信号肽剪切位点在第16~17个氨基酸,主要定位于胞外基质。Fcpg1蛋白与尖孢镰刀菌的多聚半乳糖醛酸酶蛋白序列具有较高的同源性。与野生型菌株FCN23和回补菌株ΔFcpg1-Com相比,ΔFcpg1突变体的菌落形态、营养生长和产孢量等方面均无明显差异,但突变体ΔFcpg1的致病力显著减弱。【结论】Fcpg1是典型的多聚半乳糖醛酸酶蛋白,参与对莲腐败病致病力的调控。

巨峰葡萄半乳糖醛酸转移酶基因GAUT克隆及在摘心处理下的表达分析

半乳糖醛酸转移酶(GAUT)是果胶合成过程的关键酶,对植物茎和叶的细胞壁等组织器官生长发育具有重要调控作用。为探究摘心处理下GAUT在葡萄茎和叶中的表达,以巨峰葡萄(Vitis labrusca×Vitis vinifera Kyoho)为材料,进行VvGAUTs克隆,利用生物信息学方法预测分析基因结构与功能,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在巨峰葡萄摘心处理下的表达模式。结果表明,本研究克隆得到4个巨峰葡萄GAUTs,开放阅读框(ORF)长度分别为1056、1167、1038和1071 bp,分别编码351、388、345和356个氨基酸,与葡萄基因组相应基因序列同源性均达到98%以上,分别命名为VvGAUT1a、VvGAUT1b、VvGAUT3、VvGAUT4a。VvGAUT1a编码稳定蛋白,其余3个基因编码不稳定蛋白;VvGAUTs与纤维素、木质素和糖代谢等相关蛋白密切互作。VvGAUTs在不同摘心处理的巨峰葡萄茎、叶中表达模式差异显著,2叶摘心处理总体上抑制茎VvGAUTs基因表达,而VvGAUTs在叶中的表达呈现生长前期增强、生长后期受抑制的趋势。此外,在巨峰葡萄生长前期VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3在茎、叶的表达明显高于生长后期,而VvGAUT4a在巨峰葡萄茎生长后期表达增强,在叶中表达变化较平缓。综上,摘心调控巨峰葡萄VvGAUTs基因表达,可能在控制其茎、叶生长,平衡营养生长和生殖生长过程中发挥重要作用。本研究结果为探究摘心调控葡萄树体生长的分子机制提供了理论依据。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的比较

通过基因克隆和测序方法,对来自国内外尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp.cubense(简称Foc) 1号和4号小种的6个菌株endo-PG基因同源性、与其他真菌的亲缘关系以及endo-PG基因和氨基酸序列进行分析,为香蕉枯萎病菌致病机制的研究奠定基础。结果表明,同小种的endo-PG序列同源性高,亲缘关系近,不同小种的同源性较低,亲缘关系较远;总体来说,4号小种比1号小种同源性更高,亲缘关系更近。在全基因序列分析中,没有发现明显的基因差异可以作为区分2个小种致病性差异的依据。根据预测的CDS序列翻译成氨基酸序列比对,发现6个菌株的endo-PG基因编码的氨基酸变异并没有引起相关保守结构域的变化,推测6个菌株的致病性可能与endo-PG基因的调控相关。

多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因转化加工番茄

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导将多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因导入新疆加工番茄(代号:99-162混)。卡那霉素抗性筛选,获得移栽成活的10株再生植株,PCR和Southern blot检测表明,其中4株再生植株的染色体中有外源基因的插入。所得4株转基因加工番茄在基因转化处理当代表现不同;果实饱满有光泽;Northern杂交结果表明,转反义PG基因加工番茄果实外果皮PG基因表达水平比对照低。转基因植株的表型观察和分子检测结果相吻合。

毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP的生物信息学分析

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)可特异性识别病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶,从而抑制病原菌对植物细胞壁重要成分——果胶的降解,以增强植物病原菌抗性。为探明模式树种杨树PGIP抗病机制,对毛果杨PGIP(PtPGIP)家族成员进行鉴定,以及对蛋白质理化性质和结构、系统进化、基因表达模式进行分析。结果表明,毛果杨基因组中鉴定到4个PtPGIP基因,其中,PtPGIP1和PtPGI2位于6号染色体串联重复,PtPGIP3和PtPGIP4位于16号染色体串联重复;PtPGIP1是假基因,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4具有完整的PGIP蛋白结构域。PtPGIP均为疏水蛋白,具有良好的脂溶性,且具有3~7个N-糖基化位点。亚细胞定位预测表明,其可能定位于细胞外。除PtPGIP1以外,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4蛋白均包含10个LRR片段,LRR中的保守序列xxLxLxx及蛋白质分子对接均表现出差异性。PtPGIP基因的表达具有组织特异性,PtPGIP1基因在各个组织部位的表达水平均较低,PtPGIP2和PtPGIP4基因在根、幼苗、花序中的表达量高于叶片,尤其是PtPGIP2基因在花序中的表达量最高,说明毛果杨PGIP基因家族发生了功能分化,使其在应对多种逆境胁迫中发挥重要作用。

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因反义表达载体的构建

本实验用设计好的两条 75bp的长引物进行PCR反应 ,扩增出甜瓜PG1基因的 12 8bp的片段 ,将其克隆到pMD18-T载体中 ,筛选反向克隆 ,然后将其反向构建到植物表达载体 pUC38-ACC的CaMV35S启动子和TMV增强子“Ω”的下游 ,构建成反义表达载体 pUC38-PG。用PCR鉴定重组子 ,并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体 ,为用花粉管法将其导入河套蜜瓜 。

番茄多聚半乳糖醛酸酶cDNA的克隆及其对番茄中PG表达的反义抑制

通过PCR扩增获得了包含多聚半乳糖醛酸酶(PG)全部阅读框架的1.5kb cDNA,经限制酶酶谱和部分序列分析鉴定无误后,将其以反方向插入含两个增强子的35S启动子和Nos3＇端之间,构建成表达PG反义RNA的双元载体,经农杆菌途径转化番茄品种“丽春”,获得了60株抗卡那霉素再生植株,经PCR检测,证明有2/3的再生植株有外源PG基因导入,成熟果实的PG粗提液的SDS-PAGE分析表明:若干株系中PG蛋白量较对照有不同程度的下降。PG活性亦同步下降,其中一个株系3~#,PG酶活下降了93％。这些结果表明外源PG基因的反方向导入有效地抑制了内源PG基因的表达。

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌(Valsa mali)两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过q RT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】q RT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。

Ⅱ型鼠李半乳糖醛酸聚糖的制备方法和结构表征的研究进展

Ⅱ型鼠李半乳糖醛酸聚糖(RG-Ⅱ)是果胶结构域中的一种,其结构在不同物种之间具有高度的保守性。RG-Ⅱ的主链由约9个半乳糖醛酸经α-1,4糖苷键连接而成,并被6个(A–F)明确定义的侧链取代。其中二糖侧链C、D和单糖侧链E、F的结构在不同来源的RG-Ⅱ中基本保持相同。寡糖侧链A和B则存在轻微的变异性。通过相对分子质量、单糖组成和质谱分析等手段可实现RG-Ⅱ的结构表征。中药中含有RG-Ⅱ结构域的多糖具有很高的药用价值,使用内切多聚半乳糖醛酸酶(Endo-PG)和草酸青霉可将RG-Ⅱ从中药中分离并对其在多糖中的含量进行测定。从葡萄酒中可快速制备大量RG-Ⅱ标准品用于新定量方法的开发,实现对中药活性多糖的质量控制,推动中药多糖的研究进程。

桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因MaPGIP1的克隆及功能分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是一种特异性结合和抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）活性的细胞壁结合蛋白。采用RT-PCR从嘉陵40（Morus atropurpurea Roxb.）果实中扩增PGIP基因c DNA,利用生物信息学的方法分析其编码蛋白的结构和功能。结果表明,嘉陵40PGIP开放阅读框全长1017 bp,编码338个氨基酸残基,被命名为MaPGIP1。MaPGIP1蛋白分子量37.9 k D,等电点为为6.65,信号肽为N端26个氨基酸残基,具有4个潜在的N-糖基化位点。MaPGIP1蛋白的核心区域由9个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析,MaPGIP1蛋白以包涵体形式出现,Western blot证实了重组蛋白的特异性,经过Ni-NTA柱纯化和分步透析复性后获得可溶性蛋白,该蛋白能部分抑制果桑肥大性菌核病菌（Ciboria shiraiana）PG（Cs PG）活性,其最适pH值为4.5~5.0,最适温度30℃。抑菌试验结果表明,MaPGIP1蛋白在果桑肥大性菌核病菌菌丝侵染油菜叶片过程中具有一定的抑制效果。

烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶(endo polygalacturonases,endoPGs)是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框(ORF)长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作(接种)之后该基因的表达与未互作(不接种)的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA的克隆和序列分析

以甜瓜品种河套蜜瓜成熟果实mRNA为模板,经反转录合成和PCR扩增得到编码多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因全长cDNA,将其克隆于pUC19质粒中获得重组质粒pCMPG.此cDNA长1183bp,包括一个393个氨基酸残基组成的开放阅读框架.与已报道的甜瓜PG基因cDNA核苷酸序列比较同源性为99.3%,相应的氨基酸的同源性为98.5%.

剑麻斑马纹病菌5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析

以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg1～pppg5等5个基因c DNA序列为参考,设计基因编码区特异性引物。利用5对引物分别对剑麻斑马纹病菌进行分子检测以及基因同源克隆。通过此方法首次从剑麻斑马纹病菌中获得了5个多聚半乳糖醛酸酶基因,并分别命名为Szpg1～Szpg5。检测结果表明,Szpg1～Szpg5基因普遍存在于被检测剑麻斑马纹病菌中。序列分析结果表明,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5对应基因之间存在核苷酸序列差异,由此导致个别氨基酸的差异,甚至提前终止。由此推测,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5在功能上可能存在着一定的差异。

白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的克隆、序列分析及其表达

从白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)核隐性不育两用系‘Bajh97-01A/B’可育株中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段入手,利用RACE技术成功克隆了一个花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因BcMF6的DNA和cDNA全长序列,并对其序列进行了分析。结果表明,该基因包含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为1194bp,编码397个氨基酸序列,对推导的氨基酸序列进行分析,1到22个氨基酸是1信号肽序列,其后有4个平行β螺旋重复(PbH1)结构,该序列包含3个N-糖基化位点,4个蛋白激酶c磷酸化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,10个N-豆蔻酰化位点,1个PG活性位点(227RVTCGPGHGIS.IGS240)等。将BcMF6基因氨基酸序列与数据库中的其他PGs基因进行同源序列比对,构建系统进化树,发现该基因具有所有PGs基因特有的4个保守结构域,并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类,表明该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。RT-PCR对其表达的研究表明,该基因在可育株(野生型)的中大蕾、开放花和短角果中特异表达,进一步表明该多聚半乳糖醛酸酶基因与白菜的花粉发育相关。