疱疹病毒II型糖蛋白D多聚核苷酸疫苗的初步免疫评价

将疱疹病毒II型(HSV-2)糖蛋白D(gD)多聚核苷酸疫苗肌注免疫豚鼠,初步评价其在体内所诱发的体液免疫和细胞免疫反应水平。将12只豚鼠分为3组,各组分别于舌肌注射pcDNA-gD多核苷酸疫苗、pcDNA3质粒及生理盐水,每周1次,共3次。ELISA检测豚鼠血清中gD抗体的水平;MTT法评价脾T淋巴细胞增殖反应。pcDNA-gD免疫组全部豚鼠均诱发抗HSV-2抗体(0.283±0.075);pcDNA3质粒组(0.062±0.015)和生理盐水组(0.057±0.016)的抗HSV-2抗体为阴性。pcDNA-gD免疫组豚鼠脾淋巴细胞增殖反应(2.08±0.18)程度明显高于对照组(P<0.01)。提示疱疹病毒II型糖蛋白D多聚核苷酸疫苗可在豚鼠体内诱发体液免疫和细胞免疫反应。

固定化多聚核苷酸磷酸化酶聚合生产poly Ⅰ和poly C的研究

对固定化ＰＮＰａｓｅ聚合生产多核苷酸的工艺条件了探讨，并对所得产品的性质进行了测定，所得产品符合要求。

CEA多聚核苷酸疫苗免疫源性的实验研究

以 CEA 为靶抗原的基因免疫治疗是近年来肿瘤治疗学研究的突出进展,我们用 CEA 真核表达质粒(pCEA)免疫兔子,分别以重组人 CEA 痘苗病毒(rV-CEA)和生理盐水作阳性和阴性对照。与生理盐水相比,pCEA 组和 rV-CEA 组兔血清 CEA 含量均明显升高,并出现高滴度的作用时间持续更长久。

基于DNA荧光探针的T4多聚核苷酸激酶免标记荧光检测

开发一种新型的基于DNA荧光探针的T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)活性检测方法。先设计了可以形成发卡结构的DNA探针(PNK-Tb),再通过引入T4 PNK、ATP和λ核酸外切水解酶(λ exo),打开发卡结构,释放发卡结构3’末端富含G的碱基序列,随后与Tb~(3+)结合形成G-四链体产生显著的荧光信号。通过反应前后荧光信号的变化实现T4 PNK的高灵敏检测。实验结果表明:成功制备了新的免标记DNA荧光探针,创新性地将Tb~(3+)应用到T4 PNK活性的检测中;本荧光法定量检测的线性范围为0~100 U/mL,检测下限为2 U/mL;该策略具有良好的特异性并且可用于评估ADP对T4 PNK活性的抑制作用。基于免淬灭标记DNA荧光探针构建的T4 PNK活性检测新策略反应快速 (不超过60 min)、成本低廉、灵敏度高,在药物开发以及生物化学研究中具有广阔的应用前景。

基于“分段”-“完整”转化的G-四链体脱氧核糖核酸酶传感器用于多聚核苷酸激酶的检测

采用"分段"转化为"完整"G-四链体脱氧核糖核酸酶的策略,构建了检测多聚核苷激酶(T4 PNK)的传感器。将形成G-四链体的富G序列PS5.M序列拆分成5'和3'端均为羟基的两条链:链S_1OH和链S_2OH即分别具有12个碱基的"分段"的PS5.M。在ATP存在下,T4 PNK酶可以将链S_2OH的5'端的羟基磷酸化,转化为S_2P;在S_1OH、S_2P以及Helper链S-H存在下,T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)将链S_1OH和链S_2P连接成"完整"的PS5.M序列。在体系中再加入核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ),从S-H的3'端剪切S-H,释放出PS5.M。在K^+存在下,PS5.M与氯化血红素(Henfin)作用,形成具有类过氧化物酶活性的复合物,催化H_2O_2氧化2 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)的反应,通过检测氧化产物在418 nm处的吸收值变化,实现对T4 PNK活性的定量检测。线性检测范围为0.02~3.0 U/mL舱出限为0.014 U/mL(S/N=3)。对Hela细胞和HEK293细胞实际样本的T4 PNK活性进行了检测,平均回收率为95.6%~105.7%。

实时荧光定量多聚核苷酸链式反应在高危型人乳头瘤病毒诊断中的应用价值

目的探讨实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(PCR)在高危型人乳头瘤病毒(HPV)诊断中的应用价值。方法选择2018年8月至2020年3月在宜宾市第一人民医院妇科门诊行宫颈薄层液基细胞学检查异常的105例患者作为研究对象,所有患者均行实时PCR、第二代杂交捕获技术(HC-Ⅱ)及组织病理检查,以组织病理检查结果为金标准,评估实时PCR检查高危型HPV的阳性率。结果经组织病理检查结果显示,105例患者中,炎症反应42例,宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级35例,CINⅡ级18例,CINⅢ级7例,宫颈鳞状细胞癌3例。实时PCR检查高危型HPV与组织病理检查结果具有极好的一致性(Kappa=0.771);HC-Ⅱ检查高危型HPV与组织病理检查结果具有较为理想的一致性(Kappa=0.546)。实时PCR检查高危型HPV的阳性率为87.30%,高于HC-Ⅱ检查的55.56%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实时PCR可提高高危型HPV的阳性检出率,为临床早期制定干预和治疗宫颈病变措施提供一定依据。

基于G-三链体分子信标的多聚核苷酸激酶荧光检测新方法

G-三链体(G3)由三段连续G碱基的富G序列组成的,因其潜在的生物学功能和特殊的结构受到越来越多的关注。G3序列能结合硫磺素T(ThT)发出强荧光,以此作信号报告分子,本文提出了一种基于G3分子信标(MB)的T4多聚核苷酸激酶(PNK)荧光检测新方法。有T4 PNK时,P1的5'末端被磷酸化,P1/G3MB双链结构中的P1被外切酶酶切,封闭在G3MB中的G3序列不能结合ThT,得到弱荧光信号。无T4 PNK时,P1/G3MB双链结构能阻止外切酶酶切,G3MB被打开,释放G3序列结合ThT荧光增强。该方法对T4 PNK检测的线性范围为0.0002~0.01 U/μL,检测限为0.0002 U/μL。该方法具有操作简便、成本低和选择性高等优点,并可用于T4 PNK酶活性抑制剂的评估。

最新模型的动物多聚核苷酸疫苗

早些时候一项研究提到牛接种的一种以牛疱疹病毒Ⅰ型——BHV-1 gD编码的多聚核苷酸疫苗可保护牛受强毒BHV-1的攻击。最近,加拿大的Lewis,P.J.等报导一种小鼠模型被认为是接种多聚核苷酸疫苗的免疫调节的主要部分,这种模型显示。

多聚核苷酸对小鼠急性毒性和蓄积毒性研究

本研究分别对60只和20只小鼠进行多聚核苷酸急性毒性和蓄积毒性试验。结果表明，小鼠腹腔注射多聚核苷酸注射液的LD50为0．0835g·kg^-1，95％可信限为0．06628-0．10532g·kg^-1。即蓄积系数K=LD50（n）／LD50〉5．276〉5。

多聚脱氧核糖核苷酸在组织修复中的应用进展

多聚脱氧核糖核苷酸(PDRN)为低分子量的线性多聚核苷酸片段,是良好的组织修复效应的生物活性分子,主要提取来源为鱼类生殖细胞。研究报道以及临床结果显示,PDRN具有低免疫原性和低毒性。因此,在皮肤创面修复、角膜损伤、消化道损伤修复及骨损伤修复等组织修复中显示出很好的应用潜力。本文重点对PDRN在组织损伤和修复中的应用进展进行总结,全面探讨了PDRN在组织修复中的作用和研究机制,为组织修复材料的研究及开发提供理论支持。

疱疹病毒gD基因多聚核苷酸疫苗的构建和表达

目的构建疱疹病毒 gD2基因多聚核苷酸疫苗并在实验动物中得到表达。方法将构建的 pcDNA3-gD2的质粒 DNA注射入豚鼠的舌肌中，每周 1次，共 3次，最后 1次免疫 48 h后引颈处死豚鼠，并取其舌、肝、脾、肾、心脏及股四头肌，用免疫组化法 (SP法 )检测 gD2抗原的表达。结果重组质粒组 gD2真核表达载体免疫接种后，均可在舌肌测到抗原表达，而对照组均为阴性。结论重组质粒 gD2真核表达载体可以在豚鼠舌肌中表达，对建立基因免疫防治疱疹病毒感染奠定一定基础。

点阵激光联合多聚脱氧核糖核苷酸在面部皮肤美容中的应用效果

目的:探讨点阵激光联合多聚脱氧核糖核苷酸(Polydeoxyribonudeotide,PDRN)在面部皮肤美容中的应用效果。方法:选择2020年6月-2022年3月于笔者医院要求改善面部皮肤状况的就医者98例,根据治疗方式不同分为对照组和实验组,各49例。对照组予以点阵激光治疗,实验组在此基础上予以PDRN治疗。观察治疗3个月后,对比两组疗效、症状积分、不良反应和满意度等。结果:实验组治疗有效率95.92%,高于对照组的83.67%(P<0.05),实验组就医者满意度93.88%,高于对照组的79.59%(P<0.05)。实验组总不良反应发生率14.29%与对照组10.20%差异无统计学意义(P>0.05)。结论:点阵激光结合PDRN用于面部皮肤美容疗效显著,有助于改善就医者皮肤微循环,值得临床推广。

基于核酸外切酶酶切反应的纳米金比色法检测T4多聚核苷酸激酶活性

建立了基于纳米金凝聚变色效应的检测T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）活性的方法。鉴于寡核苷酸链标记的纳米金能够稳定存在于一定浓度的盐离子缓冲溶液中,利用5＇羟基修饰的发夹型探针作为金标探针,有T4 PNK存在时,金标探针5＇羟基磷酸化,λ核酸外切酶被激活,酶切发夹型探针茎部双链DNA片段,接着在RecJf核酸外切酶作用下降解纳米金上修饰的残余的单链DNA,使得纳米金在一定盐离子浓度下团聚,溶液变成蓝紫色。结果表明,T4 PNK激酶检测的线性响应范围为0.5～4.0 U/mL,检测下限为0.24 U/mL。

多聚次黄嘌呤胞嘧啶核苷酸诱导下人外周血树突细胞的体外培养和快速成熟

目的:寻求一种快速稳定的方法从人外周血中诱导培养出成熟的树突细胞(DC)。方法:用密度梯度离心法从正常人外周血中分离出单个核细胞(PBMC),再用贴壁法获取单核细胞,在0 h加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4),随后分四组继续培养:第一组在24 h加入多聚次黄嘌呤胞嘧啶核苷酸[Poly(I∶C)],继续培养24 h,于48 h收集DC细胞,即48 h Poly(I∶C)组;第二组在24 h加入肿瘤坏死因子α(TNF-α),继续培养24 h,于48 h收集DC细胞,即48 h TNF-α组;第三组在36 h加入Poly(I∶C),继续培养36 h,在72 h时收获DC细胞,即72 h Poly(I∶C)组;第四组在36 h加入TNF-α,继续培养36 h,于72 h收集DC细胞,即72 hTNF-α组。同时设立对照组,仅加GM-CSF和IL-4。结果:经流式细胞仪检测72 h Poly(I∶C)组获得的成熟DC细胞的百分比含量最高;混合淋巴细胞培养(MLC)表明72 h Poly(I∶C)组获得的DC细胞具有较强的刺激淋巴细胞增殖的能力。结论:Poly(I∶C)诱导下人外周血DC的体外培养与成熟的方法是具有快速、稳定、经济、简便的特点,为DC的深入研究和临床应用奠定了基础。

T4多聚核苷酸激酶的原核表达、纯化及初步应用

原核表达、纯化T4多聚核苷酸激酶,并尝试将纯化的T4 PNK用于短探针序列的连接。本研究以合成的pseT基因为模板,PCR扩增出带有NdeⅠ和Bam HⅠ位点的目的片段,构建pseT-pET-15b原核表达载体,并转入E. coli ER2566中诱导表达。Ni-Agarose亲和层析柱纯化重组蛋白后,再进行Western blot鉴定。用纯化后再浓缩的T4 PNK参与探针连接反应,并设置商品T4 PNK和阴性对照。PCR扩增成功获得大于900 bp的目的基因片段,原核表达载体pseT-pET-15b构建成功,经诱导表达的重组蛋白分子量大小约为35 kD,Western blotting确认蛋白表达正确,浓缩后的蛋白浓度达到826μg/m L。电泳结果显示,重组T4 PNK在探针连接中效果较好。本研究成功表达并纯化了可溶性的T4多聚核苷酸激酶,且具有较好的活性,该蛋白可进一步用于后续大批量探针连接反应或其他相关研究,具有一定实际应用价值。

多聚脱氧核糖核苷酸对面部毛孔粗大改善的临床观察

目的探讨多聚脱氧核糖核苷酸治疗前后面部毛孔粗大的改善情况,并进行定量分析.方法本研究于2019年共纳入14例志愿者,采用多聚脱氧核糖核苷酸PDRN治疗,使用VISIA—CR(Canfield Scientific Inc,Fairfield,NJ)皮肤检测仪采集数据,计算双侧面部毛孔数量值变化,比较求美者治疗前、治疗后差异有无统计学意义.结果VISIA数据分析显示治疗后毛孔计数低于治疗前,差异均有统计学意义(p<0.05).结论通过VISIA皮肤检测仪可以有效地监测治疗前后毛孔的客观数量变化,提示多聚脱氧核糖核苷酸治疗有助于改善皮肤浅表的毛孔粗大情况.

多聚脱氧核糖核苷酸微针注射配合放血疗法治疗红斑毛细血管扩张型玫瑰痤疮的临床研究

目的研究多聚脱氧核糖核苷酸(Polydeoxyribonucleotide,PDRN)微针注射联合放血疗法对红斑毛细血管扩张型玫瑰痤疮的作用。方法临床纳入诊断为红斑毛细血管扩张型玫瑰痤疮患者30例,均使用PDRN微针注射及放血疗法的治疗,分析比较患者治疗前后各项评价指标的变化、效果及不良反应发生情况。结果治疗后患者的各项指标均有明显改善,差异有统计学意义(P<0.05);治疗有效率100%。结论PDRN微针注射配合放血疗法可用于治疗红斑毛细血管扩张型玫瑰痤。

多聚脱氧核糖核苷酸联合强脉冲光治疗面部毛细血管扩张症的临床观察

目的观察多聚脱氧核糖核苷酸(Poly Deoxy Ribo Nucleotide,PDRN)联合强脉冲光(Intense Pulsed Light,IPL)治疗面部毛细血管扩张症的疗效及安全性。方法面部毛细血管扩张症患者40例,随机分为两组:IPL组和IPL+PDRN联合治疗组。IPL组患者20例,采用IPL治疗;联合组患者20例,采用IPL联合PDRN治疗。每月治疗1次,共2次为1个疗程,疗程结束后一周比较两组患者治疗后的临床疗效。结果从治疗后皮损改善情况来看,两组患者在治疗后均有明显的好转;两组有效率比较具有显著差异(P<0.05),联合组疗效明显好于IPL组;两组都无严重的不良反应。结论PDRN联合IPL治疗对面部毛细血管扩张症有很好的疗效,且安全性高。

一种基于核苷酸激酶的ATP非标荧光检测新方法

提出了一种检测三磷酸腺苷(ATP)的非标记荧光新方法,该方法基于T4多聚核苷酸激酶调控Lambda核酸外切酶活性的原理,利用DNA荧光染料SYBR Green I作信号报告基团.有ATP时,双链DNA底物能在T4 PNK作用下发生5'端磷酸化,进而被核酸外切酶降解成DNA碎片,得到较弱的荧光信号,信号强度与ATP浓度成反比.该方法对ATP检测的线性范围为0.04~4 mmol/L,检测限为20 nmol/L.实验结果表明本方法具有快速、成本低、灵敏度高和简单易操作等优点,可进一步应用于复杂生物样品的分析.

多聚鸟嘌呤核苷酸对矽尘致大鼠肺纤维化干预作用及机制研究

目的观察多聚鸟嘌呤核苷酸(Poly G)对染矽尘大鼠肺纤维化的干预作用,并探讨其作用机制。方法无特定病原体级健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组、矽肺模型组和4个干预组(即干预1、2、3、4次组),每组5只。除对照组外,其余5组大鼠均以非暴露式气管插管法一次性予质量浓度为50.0 g/L的矽尘混悬液1.0 m L造模,4个干预组大鼠分别于造模后第1~21天内腹腔注射1、2、3、4次剂量为2.5 mg/kg体质量的Poly G。造模后28 d处死大鼠,观察肺部组织病理学改变情况,以Ashcroft评分法评估肺纤维化程度,以蛋白免疫印迹法测定肺组织内胶原样结构巨噬细胞受体(MARCO)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、E-钙黏蛋白(E-cad)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白相对表达水平。结果矽肺模型组大鼠肺泡腔内有大量尘细胞聚集,肺间质内出现弥漫性的胶原沉积,说明矽肺造模成功;干预1次组大鼠肺泡结构基本完整,肺纤维化程度较矽肺模型组明显减轻。与对照组比较,矽肺模型组大鼠肺组织Ashcroft评分和MARCO、TGF-β1、Vimentin、α-SMA的蛋白相对表达水平均升高(P<0.05),E-cad相对表达水平下降(P<0.05);与矽肺模型组比较,干预1次组大鼠肺组织的TGF-β1、Vimentin和α-SMA的蛋白相对表达水平均下降(P<0.05),E-cad相对表达水平升高(P<0.05)。Poly G干预次数与大鼠肺组织的Ashcroft评分和MARCO、TGF-β1、E-cad、Vimentin、α-SMA的蛋白相对表达水平之间均无剂量-效应关系。结论 Poly G可改善矽尘所致的大鼠肺组织炎症和纤维化,以在造模后第1天进行一次性干预(2.5 mg/kg体质量,腹腔注射)效果较好,其机制可能与低剂量Poly G抑制上皮间质转化的进程从而减少胶原合成有关。