基于DNA荧光探针的T4多聚核苷酸激酶免标记荧光检测

开发一种新型的基于DNA荧光探针的T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)活性检测方法。先设计了可以形成发卡结构的DNA探针(PNK-Tb),再通过引入T4 PNK、ATP和λ核酸外切水解酶(λ exo),打开发卡结构,释放发卡结构3’末端富含G的碱基序列,随后与Tb~(3+)结合形成G-四链体产生显著的荧光信号。通过反应前后荧光信号的变化实现T4 PNK的高灵敏检测。实验结果表明:成功制备了新的免标记DNA荧光探针,创新性地将Tb~(3+)应用到T4 PNK活性的检测中;本荧光法定量检测的线性范围为0~100 U/mL,检测下限为2 U/mL;该策略具有良好的特异性并且可用于评估ADP对T4 PNK活性的抑制作用。基于免淬灭标记DNA荧光探针构建的T4 PNK活性检测新策略反应快速 (不超过60 min)、成本低廉、灵敏度高,在药物开发以及生物化学研究中具有广阔的应用前景。

基于“分段”-“完整”转化的G-四链体脱氧核糖核酸酶传感器用于多聚核苷酸激酶的检测

采用"分段"转化为"完整"G-四链体脱氧核糖核酸酶的策略,构建了检测多聚核苷激酶(T4 PNK)的传感器。将形成G-四链体的富G序列PS5.M序列拆分成5'和3'端均为羟基的两条链:链S_1OH和链S_2OH即分别具有12个碱基的"分段"的PS5.M。在ATP存在下,T4 PNK酶可以将链S_2OH的5'端的羟基磷酸化,转化为S_2P;在S_1OH、S_2P以及Helper链S-H存在下,T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)将链S_1OH和链S_2P连接成"完整"的PS5.M序列。在体系中再加入核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ),从S-H的3'端剪切S-H,释放出PS5.M。在K^+存在下,PS5.M与氯化血红素(Henfin)作用,形成具有类过氧化物酶活性的复合物,催化H_2O_2氧化2 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)的反应,通过检测氧化产物在418 nm处的吸收值变化,实现对T4 PNK活性的定量检测。线性检测范围为0.02~3.0 U/mL舱出限为0.014 U/mL(S/N=3)。对Hela细胞和HEK293细胞实际样本的T4 PNK活性进行了检测,平均回收率为95.6%~105.7%。

基于G-三链体分子信标的多聚核苷酸激酶荧光检测新方法

G-三链体(G3)由三段连续G碱基的富G序列组成的,因其潜在的生物学功能和特殊的结构受到越来越多的关注。G3序列能结合硫磺素T(ThT)发出强荧光,以此作信号报告分子,本文提出了一种基于G3分子信标(MB)的T4多聚核苷酸激酶(PNK)荧光检测新方法。有T4 PNK时,P1的5'末端被磷酸化,P1/G3MB双链结构中的P1被外切酶酶切,封闭在G3MB中的G3序列不能结合ThT,得到弱荧光信号。无T4 PNK时,P1/G3MB双链结构能阻止外切酶酶切,G3MB被打开,释放G3序列结合ThT荧光增强。该方法对T4 PNK检测的线性范围为0.0002~0.01 U/μL,检测限为0.0002 U/μL。该方法具有操作简便、成本低和选择性高等优点,并可用于T4 PNK酶活性抑制剂的评估。

基于双菌耦合发酵策略的烟酰胺单核苷酸合成

本研究构建了分别含有烟酰胺核苷激酶(nicotinamideribosidekinase,NRK)和多聚磷酸酶(polyphosphatekinase,PPK)的双菌耦合发酵体系,实现了基于PPK的ATP再生系统在烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)生产中的应用。首先分别构建表达NRK1和NRK2的工程菌株,筛选得到高活性的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28a-NRK1,NMN产量5.17 g/L,产率77.4%;然后对NRK1的诱导表达条件进行优化,发现低温16℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.7 mmol/L、接种量3%、诱导时长22 h更利于蛋白的可溶性表达;进一步对E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1合成NMN的最优体系进行探索,发现在菌体质量浓度100 g/L、温度18℃、时间12 h、ATP与烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)浓度比1∶1.5时,NMN产量最高为5.73 g/L,产率85.78%;最后,通过对E. coli BL21(DE3)pET28a-PPK和E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1耦合发酵系统进行优化,得到最优体系为ATP与NR浓度比1∶3.5、菌体质量浓度比1∶2、发酵时间16 h,NMN产量达11.81 g/L。本研究所建立的高密度双菌耦合发酵产NMN工艺为高效、低成本的大规模发酵生产NMN开辟了新途径。

一种基于核苷酸激酶的ATP非标荧光检测新方法

提出了一种检测三磷酸腺苷(ATP)的非标记荧光新方法,该方法基于T4多聚核苷酸激酶调控Lambda核酸外切酶活性的原理,利用DNA荧光染料SYBR Green I作信号报告基团.有ATP时,双链DNA底物能在T4 PNK作用下发生5'端磷酸化,进而被核酸外切酶降解成DNA碎片,得到较弱的荧光信号,信号强度与ATP浓度成反比.该方法对ATP检测的线性范围为0.04~4 mmol/L,检测限为20 nmol/L.实验结果表明本方法具有快速、成本低、灵敏度高和简单易操作等优点,可进一步应用于复杂生物样品的分析.

基于核酸外切酶酶切反应的纳米金比色法检测T4多聚核苷酸激酶活性

建立了基于纳米金凝聚变色效应的检测T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）活性的方法。鉴于寡核苷酸链标记的纳米金能够稳定存在于一定浓度的盐离子缓冲溶液中,利用5＇羟基修饰的发夹型探针作为金标探针,有T4 PNK存在时,金标探针5＇羟基磷酸化,λ核酸外切酶被激活,酶切发夹型探针茎部双链DNA片段,接着在RecJf核酸外切酶作用下降解纳米金上修饰的残余的单链DNA,使得纳米金在一定盐离子浓度下团聚,溶液变成蓝紫色。结果表明,T4 PNK激酶检测的线性响应范围为0.5～4.0 U/mL,检测下限为0.24 U/mL。

T4多聚核苷酸激酶的原核表达、纯化及初步应用

原核表达、纯化T4多聚核苷酸激酶,并尝试将纯化的T4 PNK用于短探针序列的连接。本研究以合成的pseT基因为模板,PCR扩增出带有NdeⅠ和Bam HⅠ位点的目的片段,构建pseT-pET-15b原核表达载体,并转入E. coli ER2566中诱导表达。Ni-Agarose亲和层析柱纯化重组蛋白后,再进行Western blot鉴定。用纯化后再浓缩的T4 PNK参与探针连接反应,并设置商品T4 PNK和阴性对照。PCR扩增成功获得大于900 bp的目的基因片段,原核表达载体pseT-pET-15b构建成功,经诱导表达的重组蛋白分子量大小约为35 kD,Western blotting确认蛋白表达正确,浓缩后的蛋白浓度达到826μg/m L。电泳结果显示,重组T4 PNK在探针连接中效果较好。本研究成功表达并纯化了可溶性的T4多聚核苷酸激酶,且具有较好的活性,该蛋白可进一步用于后续大批量探针连接反应或其他相关研究,具有一定实际应用价值。

PNKP沉默对骨肉瘤放疗的增敏作用

目的研究多聚核苷酸激酶/磷酸酶(polynucleotide kinase/phosphatase,PNKP)在放疗诱导的细胞DNA损伤、细胞凋亡、细胞增殖和细胞周期中的调节作用。方法将U2OS细胞系分为3组:骨肉瘤细胞对照组、阴性si RNA转染组(si C)和PNKP si RNA转染组(si PNKP)。Western blot检测0、1、2、4、6、8 Gy 6个剂量水平γ-射线照射后U2OS细胞中PNKP的变化,CCK-8分析不同剂量γ-射线照射后细胞的存活率,彗星实验检测辐射后骨肉瘤细胞DNA的损伤,MTT法检测辐射后细胞增殖情况,流式细胞仪分析辐射后细胞凋亡、线粒体膜电位和细胞周期的变化。结果 4 Gy剂量的γ-射线可以显著降低骨肉瘤细胞U2OS中PNKP的表达(55.17%,P<0.01)和细胞的存活能力(与对照组相比下降50.16%,P<0.01)。与单独辐射组(si C+IR)对比,PNKP沉默可以抑制辐照后细胞的生长(抑制率增加到129.61%,P<0.01),增加DNA的损伤(DNA迁移量增加58.94%,P<0.01),使细胞周期停滞在S期,促进细胞凋亡以及降低线粒体膜电位水平。结论 PNKP沉默可以增加骨肉瘤细胞放射治疗的敏感性。

基于PDANPs和T4 PNK、λexo生物传感技术建立

为找到一种快速灵敏检测miRNA-199的方法,分析纳米材料PDANPs表征,构建基于聚多巴胺纳米粒子(PDANPs)和T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)、λ核酸外切酶(λexo)的新型纳米生物传感技术检测miRNA-199平台,对影响生物传感技术主要因素进行优化,分析其线性范围和检测限;与茎环引物设计荧光定量PCR方法进行比对。结果显示:合成PDANPs直径300.0±31.7 nm,表面含有丰富的π电子;反应体系荧光强度与miRNA-199浓度的对数成线性关系,F=65.183 lg C+157.3、R 2=0.973;线性范围为10 pmol/mL^100 nmol/mL;检出限值为4.62 pmol/mL;与荧光定量PCR法比对结果偏倚为-0.22105 pmol/mL。结果表明,基于PDANPs和T4 PNK、λexo新型纳米生物传感技术可用于miRNA-199检测。