HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修饰位点的鉴定

目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式和修饰的位点。方法:将构建的Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5、泛素过表达质粒、shTRAF6小干扰质粒和TRAF6 C70A位点突变质粒行不同组合转染293T细胞48 h。用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和免疫印迹(immunoblotting,IB)实验检查TRAF6与KLF5的结合以及KLF5 K63或K48多聚泛素化水平。此外,构建KLF5全部赖氨酸突变的质粒,分别与TRAF6质粒共转染293T细胞。用前述IP/IB检测KLF5 K63连接的多聚泛素化修饰,并确定KLF5 K63泛素化修饰的位点。结果:293T细胞中TRAF6能与KLF5结合;TRAF6过表达和基因沉默或TRA6酶活性缺失能相应上调或下调KLF5 K63的多聚泛素化;KLF5被TRAF6 K63多聚泛素化修饰的位点是其第99位和第100位的赖氨酸。结论:TRAF6能与KLF5相互作用,并对KLF5⁃K99和K100进行K63多聚泛素化修饰。

Smurf1通过抑制LKB1的多聚泛素化而调控其蛋白稳定性

目的:为了探寻肝脏激酶B1(liver kinase B1,LKB1)的上游调控分子,并研究其对LKB1的影响。方法:首先,利用UbiBrowser数据库预测LKB1可能的上游调控分子,并根据评分筛选出可能对LKB1具有调控作用的Smurf1基因。然后,构建Smurf1和LKB1相关过表达质粒,并转染HEK293T细胞,通过Western blot检测LKB1蛋白质表达的变化。最后,运用荧光定量PCR(qPCR)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)探索Smurf1调控LKB1可能的分子机制。结果:①成功构建LKB1和Smurf1相关过表达质粒。②在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的野生型Smurf1时其对应的LKB1蛋白相对表达量分别为0.0262±0.0007、0.0727±0.0003、0.1301±0.0013、0.4315±0.0010。经单因素方差分析,其结果为F=79636.433,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。③在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的突变型Smurf1时其对应的LKB1的蛋白相对表达量分别为0.0180±0.0001、0.0530±0.0004、0.1250±0.0010、0.2004±0.0017。经单因素方差分析,其结果为F=12887.993,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。④以GAPDH为内参,未过表达Smurf1组和过表达Smurf1组中,LKB1的相对mRNA表达水平分别为1.0851±0.4125、2.3982±1.7669。经独立样本t检验统计分析,P=0.257。⑤以β-actin为内参,未经Smurf1处理组、野生型Smurf1(WT)处理组、突变型Smurf1(C699A)处理组中LKB1的相对泛素化水平分别为1.8238±0.0278、0.0881±0.0051、0.2127±0.0062。经单因素方差分析,其结果为F=6721.953,P=0.000。与未经Smurf1处理组相比,进一步采用LSD-t法分析,野生型Smurf1组和突变型Smurf1组各组P值分别为0.000和0.000。结论:这些结果表明Smurf1通过降低LKB1的多聚泛素化从而参与其蛋白稳定性的调节。

基于串联杂合泛素结合结构域探针的多聚泛素化信号免疫组织化学检测技术研究

目的提高串联杂合泛素结合结构域(ThUBD)探针检测甲醛固定石蜡包埋(FFPE)切片中多聚泛素化信号的灵敏度。方法利用微波炉加热方法,采用不同盐离子种类和pH缓冲液进行抗原修复,在有无高浓度还原剂条件下,用ThUBD探针检测FFPE切片中的多聚泛素化信号。结果在pH 9.5 EDTA缓冲液条件下,加入50 mmol/L DTT可检测到FFPE切片中明显的多聚泛素化信号。结论pH 9.5 EDTA缓冲液中加50 mmol/L DTT有利于多聚泛素链的暴露与复原,显著提升ThUBD探针用于免疫组织化学检测的灵敏度。

TAK1赖氨酸158位点发生Lys63连接多聚泛素化在辐射诱导NF-κB激活过程中的作用

目的研究转化生长因子激酶1（TAK1）Lys63连接多聚泛素化在辐射导致的NF-κB激活过程中起到的作用及其作用位点。方法通过基因瞬时转染技术将FLAG—TAK1和HA-Ub—K63质粒共同转染至HEK-293T细胞，应用免疫沉淀和免疫印迹技术研究辐射对TAK1泛素化的影响；用稳定转染TAK1表达的HeLa细胞，证实辐射对TAK1泛素化的影响。通过免疫印迹技术，比较分析辐射对稳定转染TAK1K158R的MEF细胞与TAK1野生型MEF细胞比较分析辐射对它表达1KKs、p38及JNK的影响，以证明辐射诱导的TAK1-Lys63多聚泛素化的位点是否在TAKI赖氨酸158位点。结果瞬时转染的HEK-293T细胞接受辐射后1h开始出现明显的TAK1泛素化表现，2h更明显。在稳定表达FLAG—TAKI的HeLa细胞系中得到证实。与TAK1野生型MEF细胞相比，TAK1K158R突变的MEF细胞中辐射诱导的IKKs和p38磷酸化作用减低。结论TAK1多聚泛素化在辐射导致的NF—κB激活过程中起到关键作用，辐射所致TAK1-Lys63连接多聚泛素化发生在TAK1的赖氨酸158位点。

泛素化介导的非蛋白质降解功能

泛素因标记被26 S蛋白酶体降解的蛋白质而著名.然而近几年发现,泛素作用远不止此,不仅具有参与蛋白质降解这一重要"传统作用",还起着比先前想象更多变的、更精美的细胞调控作用,是非常重要的细胞过程的多层面调节因子,具有许多重要的非蛋白质降解功能,包括DNA损伤修复、DNA复制、信号传导、转录调节、膜运输、胞吞、蛋白激酶活化、染色质重塑和病毒芽殖.这些功能涉及多聚泛素化和单泛素化及多泛素化.因此,泛素化异常可能涉及疾病的发生和发展.对这些功能的了解可以拓展人们对泛素的认识,有助于对多种细胞过程的深入理解,也有助于相关新药的研发.

泛素链水解酶的选择性和产生机制

底物蛋白的多聚泛素链修饰参与调节多种生命运动过程(包括蛋白质降解、自噬、DNA损伤修复、细胞周期、信号转导、基因表达、转录调节、炎症免疫等).去泛素化酶通过水解底物蛋白的单泛素和泛素链修饰,对泛素相关过程进行反向调节.人类基因组中约含90余种去泛素化酶,它们通过对自身酶活性和底物识别特异性的调节,实现了对细胞内复杂泛素过程的精密且层次性的调控.本文针对去泛素化酶对不同泛素链的识别选择性,综述目前已知泛素链水解酶的选择性和产生机制.

诱导蛋白降解的小分子PROTACS的研究进展

靶向蛋白降解嵌合分子(PROTACs)是一类能够通过诱导靶蛋白的多聚泛素化而导致靶蛋白降解的小分子化合物,本文对采用不同E3泛素连接酶设计的PROTACs进行了介绍。

泛素羧基末端水解酶-1抑制剂对多巴胺能神经元的神经毒性作用

目的利用人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞观察泛素羧基末端水解酶-1（UCH-L1）抑制剂对多巴胺能神经元的毒性作用并探讨其可能的毒性机制。方法用不同浓度（5、10、25、50、75、100μmol／L）的UCH—L1抑制剂作用SK-N—SH细胞24h，MTT法检测细胞活力、Hoechst染色检测凋亡的细胞核及Western blot检测UCH—L1蛋白、单个泛素分子及多聚化泛素蛋白的表达、荧光检测泛素蛋白酶体系统（UPS）的功能。结果经UCH—L1抑制剂处理24h后SK-N-SH细胞突起样结构消失，细胞体积变小、形态变圆；随着UCH—L1抑制剂浓度的增加，细胞活性进一步下降；与对照组比较，细胞活力在抑制剂浓度为50μmol／L时，作用24h后即出现明显下降，差异有统计学意义（P〈0．05）；Hoechst染色可见凋亡细胞碎裂的细胞核；Western blot检测到细胞内UCH-L1蛋白表达没有变化、单个泛素分子水平下降、多聚泛素化蛋白增加；荧光检测显示UPS功能下降。结论UCH—L1抑制剂在体外对多巴胺能神经元有毒性作用，可诱导细胞凋亡。在凋亡过程中。UPS功能下降、细胞内多聚泛素化蛋白堆积可能发挥了作用。

蛋白降解靶向嵌合体在小分子药物研发中的机遇与挑战

蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)技术是一种通过泛素-蛋白酶体途径化学诱导靶蛋白降解的新兴策略。PROTAC是由靶蛋白配体和E3泛素连接酶配体通过适当的连接链连接而成的双功能分子,能够同时招募靶蛋白和E3泛素连接酶,从而诱导靶蛋白泛素化降解,具有广泛的应用前景和发展空间。主要简述小分子PROTAC的降解机制、发展历程,以及在药物研发中面临的机遇与挑战。