桑树多聚泛素基因的克隆及序列分析

将蒙古桑于-3℃诱导48 h后,提取幼茎RNA反转录合成cDNA(第一链),以cDNA为模板,利用RT-PCR技术克隆桑树的泛素基因(mUb)。研究结果表明:克隆片段序列为泛素基因的阅读框架,其中有2个起始密码子(ATG)和1个终止密码子(TAA),长度为459个碱基;序列与菠萝、三叶胶树、烟草等物种的泛素基因相比较,有84%以上的同源性。进一步分析表明,该基因是桑树的二串泛素基因。该基因已被GenBank收录(登录号DQ104334)。

家蚕多聚泛素基因的电子克隆、序列分析及表达谱预测

具选择性蛋白质降解功能的泛素在昆虫生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究采用电子克隆的方法钓取家蚕基因组中多聚泛素基因序列,命名为Bm-polyUB(GenBank登录号:AADK01019318),并进行序列分析和电子表达谱预测。序列分析表明,该编码区长3426bp,编码1141个氨基酸残基的15聚体,预测分子量和等电点分别为127.97kD和7.33,二级结构中α-螺旋、延伸带、β-转角和无规则卷曲各占17.09%、32.78%、14.37%和35.76%,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体各占43.5%、34.8%和21.7%,无前导肽、信号肽和跨膜区;多重序列比对显示,15个泛素单体基因序列间同源性和遗传距离分别介于89.0%～100.0%和0.000～0.120,其中Bm-UB3与Bm-UB10、Bm-UB5与Bm-UB7及Bm-UB10与Bm-UB14的序列相同;遗传多样性分析可见,共检出33个多态性位点,共生成12个单倍型,单倍型多样性(Hd=0.962)、平均核苷酸差异数(K=7.495)、核苷酸多样性(Pi=0.03287)、密码子有效值(ENC=41.623<61)、偏爱指标(CBI=0.496>0)和χ2检验计算(χ2=0.713)显示泛素单体间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性;电子表达谱预测结果表明Bm-polyUB基因在家蚕中高表达的组织和发育阶段所占比例显著高于低表达。本文的研究结果可为进一步开展该基因进化机制、表达特性和生理功能等方面的实验研究提供基础资料。

丝瓜多聚泛素基因(LcUBQ)的克隆及表达分析

泛素是一种逆境响应蛋白,所介导的泛素/26S蛋白酶体途径在植物适应逆境过程中发挥重要作用。为探究丝瓜(Luffa cylindrica)泛素基因的功能,采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术从丝瓜中克隆到多聚泛素基因(polyubiquitin gene),命名为LcUBQ(Gen Bank登录号:KR349345),该基因cDNA全长1 579 bp,包含一个1 371 bp的完整开放阅读框,编码457个氨基酸组成的蛋白质,预测其分子量和等电点分别为51.26 kDa和7.05,未发现信号肽和跨膜结构,WoLF PSORT预测其亚细胞定位于细胞质,二级结构中α-螺旋、延伸带和无规卷曲各占24.73%、22.54%和52.74%。进化树分析表明,丝瓜LcUBQ蛋白质与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物亲缘关系较近。荧光定量PCR分析发现,LcUBQ基因在丝瓜的不同组织皆有表达,其中在根和叶中表达量最低,高温(40°C)、低温(4°C)以及弱光[20μmol/(m^2?s)]均能诱导叶片中LcUBQ基因的高表达,尤其是低温胁迫。低温胁迫下,LcUBQ基因的表达量呈现先升高再下降的趋势,与其对应的泛素水平的变化基本一致,并且无论是低温或弱光处理,LcUBQ基因的表达量及对应的泛素水平均在前2 h增加得最为明显,推测LcUBQ基因可能参与丝瓜的早期胁迫信号转导及低温、弱光胁迫应答过程。

显齿蛇葡萄实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

目的筛选适用于显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)的内参基因。方法设计简并引物,采用RT-PCR从显齿蛇葡萄中克隆6个候选内参基因片段,包括肌动蛋白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18 S核糖体rRNA基因(18 S-rRNA)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin)和多聚泛素酶基因(UBQ)。应用qRT-PCR技术检测这6个候选内参基因在显齿蛇葡萄不同组织器官中(茎尖、嫩叶、成熟叶、老叶、茎和根)的表达情况。借助Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价6个内参基因的表达稳定性。通过苯丙氨酸解氨酶基因(Ag PAL)的表达分析对筛选出的内参基因进行稳定性验证。结果 18 S-rRNA、GAPDH和Actin的表达稳定性较好,适合作为显齿蛇葡萄不同组织基因表达研究的内参基因,以这3个基因为内参基因分析Ag PAL基因的相对表达量,结果发现它们在各组织器官中的表达变化趋势基本一致。结论确定显齿蛇葡萄qRT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。